肝细胞核因子4诱导肝星状细胞分化移植治疗终末期肝病

调控干细胞重要分化基因表达，是诱导定向分化肝细胞并维持生物学功能的重要方法之一，将为肝细胞移植技术提供新型的供体来源。近期研究表明肝星状细胞（HSC）是一种肝内干细胞，对肝脏发育损伤修复具有重要作用。肝细胞核因子家族（HNF）中HNF4α是促进肝细胞分化和维护其生物学功能的重要转录蛋白。本课题前期工作发现，HNF4α能够诱导HSC向肝细胞形态转变。在此基础上，我们将利用腺病毒载体上调HSC中HNF4α的表达，诱导HSC向成熟肝细胞分化，有效提高肝细胞的营养、代谢和解毒功能，同时系统探讨HNF4诱导干细胞分化的机制。进一步将供体肝细胞经脾脏注射移植于急性肝功能衰竭动物模型，评估治疗后肝功能改善和肝组织修复情况，终末期肝病采用细胞移植技术治疗提供新的临床思路。

首先克隆HNF4α基因cDNA片段，利用AdEasy腺病毒构建系统，将HNF4α基因cDNA片段外源插入病毒载体巨细胞病毒启动子（CMV）下游，构建高效表达HNF4α的重组复制缺陷型腺病毒AdHNF4α，胶原酶两步灌注法分离原代大鼠HSC，Nycodenz梯度离心纯化，然后进行原代培养。利用AdHNF4α将HNF4α基因导入原代HSC，观察HNF4α基因表达对HSC向肝细胞定向分化能力以及生物学功能的影响。. 一、构建重组复制缺陷型腺病毒AdHNF4α. 根据人HNF4α cDNA序列设计、合成引物，进行PCR体外扩增，回收大小为1425 bp的DNA片段，用EcoRⅤ和BglⅡ酶切后装入穿梭质粒pAdTrack-CMV，得到pAdTrack-CMV-HNF4α，进行测序，确保HNF4α基因扩增正确。将pAdTrack-CMV-HNF4α应用内切酶PmeⅠ酶切回收线性化pAdTrack-CMV-HNF4α,电穿孔共转化感受态BJ5183细菌,抽提质粒，测序鉴定。在293细胞包装、扩增腺病毒AdHNF4α和AdGFP，通过氯化铯梯度离心法纯化病毒，用TCID50方法测得重组腺病毒AdHNF4α滴度达到1×10(10) pfu/ml；AdGFP滴度达到3×10(10) pfu/ml。. 二、腺病毒AdHNF4α诱导原代大鼠肝星状细胞分化. 应用改良的胶原酶两步法分离培养原代大鼠HSC，平均每只大鼠可获得1.5×10(7)个HSC 。将分离原代大鼠HSC立即抽提RNA，逆转为cDNA后，PCR检测干细胞标志物CD133、GFAP、nestin、CD105，在mRNA水平，原代大鼠HSC表达上述基因。AdGFP或AdHNF4α分别以MOI 50感染大原代鼠肝星状细胞，动态观察细胞形态变化；收集感染后72 h细胞，抽提总RNA和蛋白。 RT-PCR法检测发现AdHNF4α组Ⅰ型胶原、α-SMA、TIMP-1、Vimentin基因 mRNA水平表达均较AdGFP组明显减少；上皮表型基因E-cadherin表达明显增加（P<0.05）；肝细胞功能基因GS、PEPCK mRNA表达水平表达水平明显增强（P<0.05）；可以检测出AFP、ALB的表达