柔嫩艾美耳球虫端粒酶逆转录酶相关蛋白基因克隆及功能研究

To obtain E.tenella Telomerase reverse transcriptase (EtTERT) associated protein based on the EtTERT gene that cloned by applicant before, the yeast two-hybrid system will be used in this study.The bait plasmid PGBKT7-EtTERT will be first constructed and transformed into yeast cells AH109. And self-activation of bait protein and express product will be verified. The capture plasmid pGADT7-EtcDNA will then be constructed and transformed into yeast cells Y187.And then plasmid transformed yeast cells AH109 and Y187 will be cultured together. The positive clones will be screened and sequenced.The EtTERT associated protein will be futherly identified by immunopreciptation. The function in telomerase activity regulation of associated protein genes will be analysed through gene knockout.And than more than 3 genes of associated protein that may be new targets of drug and vaccine against the parasite will be obtained,which own to independent intellectual property.It will be established a basis on study the mechanism of telomerase activities, cell cycle regulation and control of coccidiosis . So it has an important theoretical significance and application prospects in the future.

本研究拟在申请者前期克隆获得的柔嫩艾美耳球虫端粒酶逆转录酶(EtTERT)基因的基础上，利用酵母双杂交技术首先构建诱饵融合蛋白表达质粒PGBKT7-EtTERT并转化酵母菌株AH109，同时进行诱饵融合蛋白自激活检测以及表达产物鉴定，后构建pGADT7-EtcDNA文库质粒并转化酵母菌株Y187，将PGBKT7-EtTERT转化菌株AH109与pGADT7-EtcDNA转化菌株Y187混合培养，进行阳性克隆筛选并测序分析,并利用免疫共沉淀进一步验证EtTERT相关蛋白存在，后利用基因敲除技术对获得的EtTERT相关蛋白基因进行功能分析，确定其在端粒酶活性调节中的作用。以期获得3个以上具有独立知识产权的EtTERT相关蛋白基因及防治球虫病的潜在药物和疫苗作用靶位，从而为下一步深入研究柔嫩艾美耳球虫端粒酶活性和细胞周期调节机制以及球虫病防治等奠定良好基础。因而具有重要的理论意义和应用前景。

鸡球虫病是由艾美耳属球虫引起的一种严重危害养鸡业发展的寄生虫病。鸡球虫常见的有7种，其中以寄生于鸡盲肠的柔嫩艾美耳球虫危害最大。目前防治鸡球虫病的方法主要有药物和疫苗两种，但由于对球虫的细胞和分子生物学等缺乏详尽了解，迄今尚无理想的控制鸡球虫病药物和疫苗。因此加强对球虫细胞和分子生物学研究，揭示球虫的细胞和分子生物学特性，寻找新的药物和疫苗作用靶位对防治鸡球虫病是十分重要的。本项目利用酵母双杂交技术构建柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）酵母双杂交cDNA文库以及诱饵融合蛋白表达质粒PGBKT7-EtTERT并转化酵母菌株AH109，同时进行诱饵融合蛋白自激活检测以及表达产物鉴定，后构建pGADT7-EtcDNA文库质粒并转化酵母菌株Y187，将PGBKT7-EtTERT转化菌株AH109与pGADT7-EtcDNA转化菌株Y187混合培养，进行阳性克隆筛选并测序分析,并利用pull-down、免疫共沉淀进一步验证EtTERT相关蛋白存在。利用基于柔嫩艾美耳球虫病毒载体介导的核酶对获得的EtTERT相关蛋白基因进行功能分析，确定其在端粒酶活性调节中的作用。结果成功获得了3个EtTERT相关基因蛋白即：14-3-3、OTU和Hsp90等，利用基于柔嫩艾美耳球虫病毒载体介导的核酶对获得的EtTERT相关蛋白基因14-3-3等进行功能分析，结果发现14-3-3表达水平的降低可上调E.tenella端粒酶活性，OTU对于端粒酶活性具有正向调节的作用。此外，鉴定获得了1个E.tenella端粒结合蛋白Gbp1p。本研究建立的基于柔嫩艾美尔球虫病毒的转染载体可为EtTERT相关蛋白基因功能的筛选提供了平台；筛选获得的EtTERT相关基因蛋白14-3-3、OTU和Hsp90以及Gbp1p等可为深入研究柔嫩艾美耳球虫端粒酶活性和细胞周期调节机制提供依据，同时亦为防治球虫病药物和疫苗提供潜在的作用靶位。因而具有重要的理论意义和应用前景。本研究共发表论文5 篇，其中SCI论文3篇，申报国家发明专利3项，其中获得授权发明专利1项，培养研究生3 名。