贾第虫端粒酶相关蛋白筛选及其在双核中的定位与功能研究

According to immortalized phenomenon of protozoan Giardia contained two nuclei which can be passaged repeatedly in vitro and theory of close relation between telomerase and cell immortalization, GdTERT associated protein will be studied.The GdTERT associated proteins will be screened using yeast two hybrid. By bimolecular fluorescence complementation technology, the interaction of among proteins and localization in two nucleuses of Giardia will be determined. The regulated telomerase activity of proteins will be identificated using gene transfection and knockout technique. It will provide experimental data to clarify the regulation mechanism of telomerase activity and reveal the function of two nucleuses,immortalized phenomenon or survival strategy of Giardia. Also, it will provided new drug and vaccine targets against Giardia. So it has important theoretical significance and application prospect.

本研究根据贾第虫这一双核原生动物在体外可反复传代培养呈现“永生化”现象以及端粒酶与细胞永生化密切相关的理论，从贾第虫端粒酶GdTERT相关蛋白为切入点，利用酵母双杂交技术筛选GdTERT相关基因蛋白，通过双分子荧光互补技术确定其在贾第虫体内互作及在双核中的定位，采用基因转染和敲除技术确定GdTERT相关基因蛋白在端粒酶活性调节中的作用，从而为揭示贾第虫端粒酶活性调节机制、双核功能、“永生化”现象或生存策略提供试验数据。同时也为贾第虫病防治提供新的药物和疫苗作用新靶位， 因而具有重要的理论意义和应用前景。

贾第虫具有功能未知的“双核”，是研究真核生物的良好模式生物，被称为“生物活化石”。贾第虫的滋养体可在体外反复传代培养，呈现“永生化”现象。贾第虫也是一种重要的水传性人兽共患原虫，曾被称为“旅行者腹泻”。但迄今尚无理想的防治办法。究其原因就是对贾第虫细胞和分子生物学如端粒酶调控等特性缺乏详尽的了解。因此揭示贾第虫端粒酶相关蛋白的功能及其在贾第虫“双核”中的定位，对探明贾第虫“永生化”的机制、寻找新的防治贾第虫病药物和疫苗作用靶位是十分重要的。本项目首先构建贾第虫酵母双杂交cDNA文库以及诱饵融合蛋白表达质粒pGBKT7-TRBD，转化酵母菌株AH109，同时进行诱饵融合蛋白自激活检测以及表达产物鉴定，后构建pGADT7-cDNA文库质粒并转化酵母菌株Y187，将pGBKT7-TRBD 转化菌株AH109与pGADT7-cDNA转化菌株Y187混合培养，进行阳性克隆筛选并测序。利用pull down、免疫共沉淀等进一步验证TRBD互作蛋白存在，结果成功获得了贾第虫锌指蛋白ZFD、热休克蛋白90以及ATP酶等基因蛋白。后利用双分子荧光互补系统和Duolink® PLA技术确定了GdTRBD与ZFD、复制因子C-亚基1 (RFC1)以及ATP酶等基因蛋白在双核的共定位，结果发现GdTRBD与ZFD和RFC1分别共定位于双核和单核等。通过生物信息学分析发现了ZFD调控蛋白GSB_4558。此外，基于贾第虫病毒载体介导的核酶对获得的TRBD互作蛋白基因进行功能分析，结果发现ZFD、RFC1等对贾第虫端粒酶活性呈正向调节的作用。本研究搭建了GdTERT相关基因蛋白筛选和功能以及贾第虫体内互作蛋白共定位研究平台。其结果对下一步深入研究贾第虫端粒酶调节机制和双核功能、揭示贾第虫“永生化”现象以及高等动物端粒酶调控机制的研究提供了重要基础和借鉴。同时，也为贾第虫病防治提供新的潜在药物作用靶位，具有重要的理论意义和应用前景。本研究共发表论文6篇，其中SCI论文3篇，申报国家发明专利2项，培养研究生3名。