激活型肝星状细胞(HSC）特异性结合多肽筛选的基础研究

慢性病毒性肝炎所致肝纤维化是严重影响我国人民健康的常见病、多发病之一。目前临床上采取多种综合防治措施，取得了一些进展，但效果仍不理想，主要原因是防治方法缺乏特异性、靶向性，成为阻碍肝纤维防治水平提高的瓶颈之一。肝纤维化防治方法的特异性是目前亟待解决的问题。.防治方法特异性的提高关键在于提高药物或试剂的靶向性，激活型肝星形细胞（HSC）是肝纤维化干预的关键靶点，而针对激活型HSC靶向性分子的筛选研究鲜有报道，加强这方面的研究有助于提高针对激活型HSC的药物或诊断试剂靶向性。.研究表明，短肽是靶向分子的良好候选物，本课题拟通过噬菌体表面展示技术筛选与激活型HSC特异性结合的七肽，并通过体外和体内实验验证候选七肽的靶向组织特异性及细胞特异性，评估其结合能力。为开发针对激活型HSC的靶向性治疗药物及诊断试剂进行前期研究，以期突破肝纤维化防治的瓶颈。

肝纤维化（hepatic fibrosis）是严重影响人民健康的严重疾患之一。肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）激活在肝纤维化发生的病理过程中扮演着关键性角色，也是肝纤维化防治的关键靶点。噬菌体表面展示技术是一种将外源蛋白或多肽与噬菌体表面特定蛋白融合并展示于其表面的生物技术，利用该项技术可以简便快速地筛选到与配基具有强亲和力和高特异性的配体。. 本课题在研究中对传统分离大鼠原代HSC的方法进行大胆改革，通过自行设计的循环灌注仪，提高了原代大鼠HSC分离获取率，解决了本研究需要大量原代HSC的瓶颈问题。实验中发现TGF-β刺激活化的HSC细胞分布与活化程度很不均匀，而自发活化的大鼠HSC，细胞分布均匀、活化程度比较一致，更适合于筛选。我们选用NEB公司环七肽库，采用噬菌体展示技术以静止型HSC为吸附细胞，激活型HSC为靶细胞，经4轮体外差减筛选，对筛选得到的阳性噬菌体进行DNA测序比对，鉴定出20种能与激活型HSC特异性结合的阳性噬菌体，其中插入了某序列的噬菌体(命名为Q噬菌体)出现频率最高，所展示的多肽为Q肽。经ELISA检测，Q噬菌体与激活型大鼠HSC具有较高的亲合力。免疫荧光检测发现：在体外Q 噬菌体与静止型 HSC（原代分离培养 24h 的大鼠 HSC）、人肝细胞株LO2 及人肝癌细胞株 HepG2 基本不结合，而与不同来源的激活型 HSC（如原代培养自发活化的大鼠 HSC、人肝星状细胞株 LX-2 及大鼠肝星状细胞株 HSC-T6）都有比较高的结合率。体内检测发现：Q噬菌体在肝纤维化大鼠肝组织内有富集，提示其具有明显的组织特异性。为进一步验证Q肽在脱离噬菌体这个载体后仍然能与激活型 HSC 特异性结合，目前课题组正采用人工合成的罗丹明B标记Q肽，在共聚焦显微镜下观察罗丹明B-Q肽是否能够很好地与激活型HSC特异性结合，而不与静止型HSC结合或基本不结合。这部分实验正在进行中，近期可以获得最后结果。. 总之，本课题全部研究内容基本完成，项目研究成果正在整理中。预计在原来已经获批 1项专利和发表1篇核心论文的基础上，还可以再申请1项专利和发表1篇SCI论文。本项目不仅为肝纤维化靶向诊断与治疗提供新的思路，同时提升了课题组科研能力和水平，科研团队人才建设也取得显著成绩。