糖调节蛋白78在大鼠肠源性内毒素引发肝肺综合征肺血管重构中的作用

肝肺综合征（HPS）是在急慢性肝病（尤其是肝硬化）基础上发生的并发症，发病机制尚未完全清楚。本项目以内质网应激理论为指导，在申请人前期相关研究（肠源性内毒素血症在肝肺综合征发病中作用的实验研究）满意的基础上，结合内质网应激的科研实践，提出内质网应激分子糖调节蛋白78（GRP78）在肠源性内毒素血症引发HPS肺血管重构中起关键作用的假说。通过进一步观察肠源性内毒素血症引起肺组织内质网应激和GRP78表达变化以及与肺血管重构的关系，进而采用内质网应激拮抗剂或RNAi方法抑制GRP78基因表达的研究，与对照组随机、双盲比较肺血管重构以及动脉血液氧合的差异，揭示HPS肺血管重构的有效机制，为其防治提供理论依据。目前国内外文献尚未见内质网应激以及GRP78在HPS发病中作用的报道，该项目首次揭示它们在HPS发病中的关键作用，阐述新的HPS发病学原理，为HPS以及其它疾病中内毒素血症的防治提供新思路。

研究发现，内质网应激的标志分子糖调节蛋白78（GRP78）高表达与肿瘤等多种疾病的发生密切相关，而内毒素是重要的应激原之一，因而我们重点探讨了GRP78在肠源性内毒素引发肝肺综合征肺微血管重构中的作用。在肝肺综合征大鼠模型上：证实了肺组织内质网应激的发生以及其标志分子GRP78的表达变化；探讨了肠源性内毒素血症引起肺组织GRP78增加的机制；观察了肺组织中与血管生成相关因子的表达情况；证实了GRP78通过VEGF途径在肝肺综合征肺微血管重构中起重要作用；使用大黄素（20mg/kg.w/d，灌胃）和甜菜碱（250mg/kg.w/d，灌胃）对肝肺综合征的发病过程进行干预，二者在对抗内质网应激和降低VEGF-A表达水平上显示出不同的时相特征。基因干扰是深入探讨发病机制的重要手段，但是抑制肺脏特异的基因表达（knockdown）是一个较大的难题。我们采用Stealth RNAiTM siRNA技术合成的GRP78-siRNA,所配置溶液经尾静脉缓慢注射，获得了较为满意的干扰效果，筛选出了作用有效的序列。进一步合成RadE5-rGrp78shRNA腺病毒（重组rGrp78基因shRNA），以及rAd5- Grp78腺病毒（重组过表达Grp78基因），分别观察它们对肺巨噬细胞、肺微血管内皮细胞以及二者混合培养细胞中VEGF-A的表达变化，证实GRP78表达增加是促进肝肺综合征肺微血管重构的关键分子。我们还同时观察了同一动物模型中心脏功能和形态学的改变，并探讨了其发生机制；初步观察了脑组织形态学的变化。通过系列研究，① 证实了内毒素可以直接引起内质网应激、也可以通过引发肺组织的氧化应激间接诱导内质网应激，表达增高的GRP78通过VEGF途径引起肺微血管重构，导致肝肺综合征发生，验证了原有的假说；② 采用Stealth RNAiTM siRNA技术合成的Grp78-siRNA经尾静脉缓慢注射，建立了成功抑制肺脏GRP78基因表达的动物模型；③ 通过对肝硬化动物肺脏和心脏的对比研究，发现肠源性内毒素引起的内质网应激程度不同，进而对不同组织器官损害的机制也不同，为防治肝硬化各种并发症的深入研究提供了新思路；④ 通过使用大黄素拮抗内毒素，使用甜菜碱对抗内质网应激，进一步反证了肠源性内毒素和GRP78在肝肺综合征发病中的作用及其机制。