登革病毒膜融合关键位点的发现与确认

登革病毒为有包膜的单股正链RNA病毒，位于包膜E蛋白第98-110位的融合肽介导病毒与宿主细胞膜融合，在病毒感染和致病过程中发挥重要作用。最近，我们获得了一株对登革1-4型病毒具有强中和活性的单克隆抗体，该抗体特异识别由融合肽98、99和101位氨基酸构成的一个全新抗原表位，很可能是决定融合肽功能的关键位点，并影响病毒感染特征与致病性。因此，本研究拟首先利用抗体压力筛选登革病毒中和逃逸株，结合序列分析明确抗体识别的关键氨基酸位点。然后，利用反向遗传学技术在上述关键位点引入一系列突变，通过细胞-细胞融合试验比较突变株与亲本株在膜融合活性上的差异，确定这几个位点与病毒膜融合的关系；并通过观察细胞病变、一步生长曲线、蚀斑特征和神经毒力等系统分析突变株的生物学特征，明确这几个位点对病毒感染特征与致病性的影响。本项目的完成, 将能够发现一系列膜融合关键位点，为登革病毒感染和致病机理的阐明奠定基础。

本项目的研究计划包括利用抗体压力筛选登革病毒中和逃逸株，结合序列分析明确抗体识别的关键氨基酸位点。利用反向遗传学技术在上述关键位点引入一系列突变，通过细胞-细胞融合试验比较突变株与亲本株在膜融合活性上的差异，确定这几个位点与病毒膜融合的关系；并通过观察细胞病变、一步生长曲线、蚀斑特征和神经毒力等系统分析突变株的生物学特征，明确这几个位点对病毒感染特征与致病性的影响。.本项目按计划开展了研究工作，基本完成预定的研究目标，取得了以下重要的研究结果：1）、通过对中和逃逸株的一系列生物学功能分析发现，E蛋白结构域II区126位通过降低病毒E蛋白介导的膜融合活性影响2A10G6抗体的中和活性，同时也显著降低病毒的乳鼠神经毒力。2）、通过计算机模拟分析发现，2A10G6抗体可能以E蛋白W101位为核心，在E蛋白动态变构的过程中通过与邻近W101位的不同氨基酸位点结合，进而阻碍病毒与宿主细胞的膜融合。3）、通过反向遗传学技术发现，与2A10G6结合和中和有关的关键性氨基酸位点在病毒水平不易发生突变，间接表明这些位点可能在维持登革病毒结构与功能上发挥重要作用。.在本项目的资助下，共发表SCI论文8篇，中文核心期刊论文1篇。待发表SCI论文1篇。在项目实施过程中，项目负责人充分锻炼了自身的科研能力，研究水平得到了很大的提高。2013年参加了第十届全国病毒学学术研讨会。此外，本课题也协助培养2名硕士研究生，分别已于2012年和2013年毕业。