Ad/rAAV杂合体病毒介导RNAi抗HBV实验研究

（1）筛选RNAi抗HBV的有效序列；（1）将产生shRNA的表达盒克隆入AAV的ITR之间，形成无Rep和Cap基因的rAAV，再将其重组入腺病毒穿梭质粒中；（2）把Rep基因置于HBV基本核心启动子（BCP）驱动下，也重组入腺病毒穿梭质粒中，将来用于从腺病毒基因组中拯救rAAV并恢复其定点整合能力；（3）用细菌内高效同源重组法构建重组Ad／rAAV杂合体病毒；（4）Ad／rAAV感染肝细胞后，随着HBV 3.5 kb mRNA的转录，Rep基因在BCP控制下，也进行转录，表达的Rep蛋白将rAAV基因组拯救出来，大量复制，并介导其定点整合至靶细胞染色体中；（5）整合rAAV长期表达shRNA，使RNAi抗HBV具有持久性。Ad／rAAV既有腺病毒的感染性和易于生产的优点，又恢复了rAAV定点整合能力，克服了腺病毒表达外源基因时间短和rAAV制备难的缺陷，使RNAi具有了长效性。