肌醇对天蓝色链霉菌发育分化影响机制的研究

链霉菌分化调控的研究是目前国际微生物研究领域的前沿学科。WhiI是天蓝色链霉菌分化的一个关键的调控子，控制链霉菌分化过程由气生菌丝的生长到形成成熟孢子的发育转变。前期的研究发现，受WhiI影响的链霉菌肌醇合成与天蓝色链霉菌分化进程密切相关，链霉菌在分化的不同阶段对肌醇的需求量不同，而链霉菌是通过WhiI及InoR两个调控因子控制肌醇合成中关键酶（肌醇-1-磷酸合成酶，mIPS）的表达量从而控制肌醇的合成量来影响分化的，这一发现可以成为链霉菌分化研究的一个新切入点。然而肌醇影响链霉菌分化的具体机制还有待进一步阐明，且我们认为肌醇可能并非是影响链霉菌分化进程的最终效应分子，因此本申请项目拟以天蓝色链霉菌为研究材料，从肌醇在链霉菌内可能的进一步代谢途径入手，对这些途径进行阻断并观察对分化的影响，逐步揭示肌醇可能通过什么样的代谢途径或代谢衍生物来影响分化，进而对其影响分化的机制进一步深入探索。

链霉菌具有相对其他原核生物较复杂的发育分化生命周期，同时又可以产生众多对人类健康有着重要意义的次级代谢产物，因此链霉菌是原核生物中一类既有理论研究价值又有应用前景的模式微生物，对链霉菌发育分化调控的揭示，无疑会为研究复杂的基因时空表达网络提供理论指导。. 本研究是在发现了链霉菌肌醇的从头合成途径对生长及分化有重要影响，且在分化的不同阶段受时空调控的基础上，对肌醇合成的精细调控进行了全面的研究，同时进一步探索了肌醇影响天蓝色链霉菌发育分化的机制。研究中我们得到了WhiI调控蛋白C-端DNA结合结构域的可溶性表达，得以在体外开展WhiI与InoR共同调控肌醇合成的关键基因inoA表达的分子机制的研究，弄清了WhiI及InoR对inoRA转录单元调控的作用位点，从而阐明了WhiI及InoR在基因表达的时空调控中是如何协调互作，使肌醇的合成在分化的不同阶段受到精细调控，既满足在不同分化阶段的需求量变化，又不会影响链霉菌的正常生长，进而提出了较完善的肌醇合成在链霉菌分化各阶段的调控模型。其中我们首次获得了WhiI直接作用其靶基因的分子证据，WhiI作为重要的分化调控因子，不但影响分化基因的表达，同时影响基础代谢相关基因的表达，成为一个新的链霉菌发育分化调控的范例。. 另外我们针对肌醇可能通过进一步代谢影响到链霉菌细胞膜重要组份磷脂酰肌醇（PI）的合成，进而影响分化的推测机制进行了相关研究，首先通过额外克隆已验证功能的结核分枝杆菌pgsA1基因可以成功敲除天蓝色链霉菌上与pgsA同源的看家基因（SCO1527），从而证实了天蓝色链霉菌中的pgsA同源基因确实与PI的合成相关，且是链霉菌的必须基因，进而通过克隆一段与天蓝色链霉菌pgsA同源基因编码链互补（包括部分上游调控序列及编码序列）的317bp片段，置于链霉菌可诱导高表达启动子控制下，通过诱导高表达获得大量反义RNA对链霉菌pgsA基因进行knockdown，可以抑制链霉菌的生长，从而阐明了肌醇合成量对分化的影响是通过影响了PI合成而起作用的机制。