天蓝色链霉菌sigma因子SigT的调控机制研究

天蓝色链霉菌含数量众多的ECF sigma因子，在环境胁迫应答、形态改变、初级和次生代谢转换等过程中发挥重要的转录开关作用。对其中SigT所在的操纵子研究发现sigT和其抗sigma因子rstA的缺失株同时表现分化加快，抗sigma因子RstA对SigT蛋白稳定性是必需的，并发现了SigT潜在的抗抗sigma因子RstB，提示可能存在一个全新的抗sigma因子调控机制。. 本课题将综合运用生物信息学、蛋白质免疫共沉淀、体外转录分析、分子活体影像、蛋白磷酸化、DNA-蛋白质相互作用等技术，系统研究sigT的结构功能、转录活性调控、亚细胞定位和对下游基因的转录调控网络,阐述SigT操纵子在天蓝链霉菌形态分化、环境胁迫应答和次生代谢过程中的作用，进一步阐明ECF家族sigma因子在链霉菌多种复杂生命活动中新的调控机制，为系统解析链霉菌sigma因子调控网络提供基础。

已超额完成了计划书规定的任务，在JBC、AEM、JB、AMB等领域著名刊物发表8篇较高质量的SCI论文，阐述了σ因子稳定性与细胞分化的相互调控关系，深刻揭示了σ因子在体内的降解机制及其生物学意义。. 首先发现了天蓝色链霉菌中SigT蛋白在敲除rstA突变体中消失，表明抗σ因子RstA对于SigT的潜在独特调控机制。通过构建组成型高表达高拷贝穿梭质粒，发现不同的生理条件下SigT可调节次级代谢过程，表明SigT响应了环境信号选择性介导不同靶基因的表达来调控细胞分化。研究表明sigT敲除缺失株在磷酸盐胁迫下，抗生素Act和Red产生提前，且产量提高；在氮源胁迫时，sigT敲除缺失株的抗生素产量明显低于野生型，显示SigT对次级代谢具有正调控作用，RT-PCR分析表明SigT的表达受到氮源胁迫正向调控；转录分析发现，严谨响应相关的ppGpp合成酶基因relA和磷酸盐转运基因pstS受到SigT的正向调控，从而揭示了SigT在营养胁迫下对链霉菌次级代谢的调控作用。. 研究发现抗σ因子RstA能够稳定SigT蛋白，即正调节SigT蛋白活性，而不是拮抗σ因子，与传统的σ调控机制完全不同。SigT蛋白降解是通过体内ClpP/SsrA途径进行的，SigT反过来能够直接结合到clpP基因启动子上负调控clpP/ssrA基因表达，次级代谢产物能够破坏该结合，表明体内存在一个双重正反馈调控机制来快速降解SigT蛋白，启动细胞分化过程。胞内蛋白酶体在SigT的降解过程中也发挥重要作用，在rstA 敲除突变株中敲除蛋白酶体β/α亚基 (prcB/A)并不能回复SigT蛋白的稳定性，表明蛋白酶体的降解作用是间接效应；同时敲除prcB/A的缺失株抗生素产量下调，而过表达redD或actII-orf4则能促进prcB/A敲除缺失株中SigT蛋白的降解，表明蛋白酶体影响次级代谢产物的合成，再通过双重正反馈机制来调节SigT蛋白稳定性。. 综上所述，抗σ因子RstA是SigT蛋白稳定的必要条件，RstA蛋白被降解后，导致了ClpP/SsrA依赖性的SigT蛋白以一种双重正反馈调节模式被降解，次级代谢产物充当了适时和不可逆的细胞分化进程中SigT降解的调控因子。这一新机制加深了对于细胞元件协同作用维持转录调控因子适当蛋白质水平，以实现正常细胞发育和环境适应机制的认识。