一种肺炎链球菌荚膜多糖表面连接蛋白的功能鉴定

荚膜多糖是肺炎链球菌的主要毒力因子。肺炎链球菌多糖链的胞内聚合这一机制已比较明确，但合成后的多糖链如何连接到肺炎链球菌表面迄今未明。肺炎链球菌SPD-1672蛋白为我们前期研究筛选出的一个体内诱导基因的表达产物，生物信息学分析和体内荚膜诱导实验均提示该蛋白具有荚膜多糖链连接酶的特征；而且spd-1672基因的缺陷菌与野生菌相比，具有较强的体内毒性，提示SPD-1672蛋白是一种具有多糖连接酶性质的表面毒力因子，需要进一步鉴定。本课题拟通过表达、纯化SPD-1672蛋白，进行体外连接酶活性实验，证实SPD-1672蛋白的荚膜多糖链连接作用；并构建spd-1672基因缺陷菌，利用体内攻毒实验和体外中性粒细胞抗吞噬实验分析其毒力机制。.本研究可揭示肺炎链球菌胞内多糖链合成后连接到细胞表面的分子机制，并阐明肺炎链球菌SPD-1672蛋白的毒力机制。

荚膜多糖和磷壁酸是肺炎链球菌重要的毒力因子，其构成比较复杂。磷壁酸等多糖分子的合成通常始于短链重复单元的生成，通过聚合形成长链分子，最终锚定至细菌菌体表面，这一过程非常复杂，不同种属细菌差异很大，在肺炎链球菌中磷壁酸的生物合成机制迄今未明。.SPD_1672为我们前期研究筛选出的一个体内诱导基因的表达产物，生物信息学结果提示它具有O-抗原连接酶和多糖重复单元聚合酶的特征。本课题计划纯化该蛋白，通过体外连接酶活性实验证实该蛋白的荚膜多糖或聚合或链连接作用；并构建SPD_1672缺陷菌，利用攻毒实验和天然免疫细胞和因子杀伤实验分析其毒力机制。.但在第一年的研究中发现，SPD_1672缺陷菌其细胞壁外的荚膜表达无明显改变，有差异的是小分子多糖，经咨询和鉴定为磷壁酸，本课题因而转向为SPD_1672基因对磷壁酸的影响研究。.根据实验计划方案，我们试图原核表达该蛋白，未能获得成功。究其原因，可能与SPD_1672的多次跨膜特征有关。随后，我们构建了SPD_1672缺陷的肺炎链球菌，利用Western blot，流式细胞术等技术分析了菌体表面多糖聚合物，最终证实SPD_1672是一种磷壁酸聚合酶。此后，围绕蛋白活性和结构展开研究，认识到SPD_1672为偶数次跨膜蛋白，膜外第四个环为该酶的活性结构域，第304位组氨酸为酶活性关键氨基酸。SPD_1672在链球菌中高度保守。.在毒力研究实验中，我们观察到腹腔注射同等剂量的ΔSPD_1672 D39缺陷菌，小鼠存活时间比感染野生细菌显著延长，说明SPD_1672与细菌毒力密切相关。之后，我们设计了细菌体内外生长速度、体外细胞粘附实验，体内定植和侵袭实验等去揭示缺陷菌毒力下降的原因。最终，我们认识到SPD_1672的缺失致使细菌生长变缓；缺陷菌粘附和定植能力显著下降，这些与聚合化的磷壁酸减少有关。但SPD_1672 缺陷菌对天然免疫系统杀伤敏感性大致相同。总体而言，聚合化磷壁酸减少的肺炎链球菌其毒力下降主要与其生长缺陷和宿主定植能力减弱有密切的关系。.本研究揭示了肺炎链球磷壁酸多糖分子菌体表面聚合的分子机制，阐明肺炎链球菌SPD_1672蛋白的毒力机制，并为抑菌药物或蛋白疫苗的设计提供了一个有效作用靶点。.本课题培养了1名博士（在读）、3名硕士研究生（已毕业），目前已在国内外专业核心期刊上发表了6篇论文，还有一篇SCI论文即将投稿。