灰绿曲霉纤维素酶高效表达与调控机理

纤维素生物质是地球上最丰富的可再生资源，利用纤维素酶将纤维素降解为单糖，再转化人类所必需的生物燃料与生物基材料，具有重要的战略意义。.构建灰绿曲霉 EU7-22 cDNA文库，克隆内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶基因，并对纤维素酶结构基因进行改造，获得具有更高活力或分子量相对较小的突变体；克隆纤维素酶转录激活因子（Xyr1，Ace2 ，Hap2/3/5）和负调控因子（Ace1，Cre1）基因，研究转录调控因子与纤维素酶基因表达调控的相互关系，构建去阻遏的纤维素酶表达的受体菌株；分析在去阻遏条件和诱导条件下灰绿曲霉EU7-22分泌蛋白表达谱，确定高丰度的分泌表达蛋白，克隆并分析高丰度表达蛋白基因及其启动子；构建含内源高表达启动子和调控序列的基因整合表达载体，体外重组纤维素酶突变体基因，导入灰绿曲霉受体细胞，筛选高效表达纤维素酶的工程菌株，建立工程菌株最佳产酶条件。

申请书中的灰绿曲霉，经进一步研究，鉴定为东方肉座菌EU7-22，为本实验由东方肉座菌XC-9通过复合诱变获得的突变株，其本身不但能够分泌外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶，也可以产生大量的半纤维素酶，这对降解纤维素生物质极其有利。但是该菌株EU7-22生产的纤维素酶仍然不能够满足工业要求。因此从分子水平上对菌株进行改造，提高酶活性是一种重要的手段。本论文以基因为切入点，取得的主要结果如下：.从东方肉座菌EU7-22中首次成功克隆得到了纤维素酶基因（cbhⅠ、cbhⅡ、egⅠ、egⅡ、egⅢ、eg Ⅳ、β-bgl1），半纤维素酶基因（xynⅠ、xynⅡ、β-bxl1）及其转录调控因子基因（cre1、ace1、xyr1、hap2、hap3、hap5）。这些克隆的基因及编码蛋白质得序列与木霉属其它菌株如里氏木霉，绿色木霉和康宁木霉相应基因及编码蛋白同源性最高达到99%。.SDS-PAGE分析菌株EU7-22在以预处理芒草为诱导物和3%的葡萄糖为阻遏物条件下的分泌蛋白。有5个特殊蛋白条带（band Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ）没有被葡萄糖阻遏抑制。MALDI-TOF/TOF鉴定band Ⅰ属于天冬氨酸蛋白水解酶，这也是表达量最强的蛋白质，在这五种蛋白质中；band Ⅲ 和Ⅳ属于一种预测蛋白；band Ⅴ属于木葡聚糖酶或β-木糖苷酶。PCR扩增得到菌株EU7-22 蛋白条带Ⅰ基因序列全长1280 bp，与里氏木霉的 proA 基因同源性最高达100%。该基因含有1个内含子，编码天冬氨酸蛋白水解酶，包含407个氨基酸，预测的相对分子量为42.6 kDa。采用Genome Walking 技术克隆得到1200 bp 的 proA 上游区域序列，该序列含有典型的启动子特有元件：1个TATA 盒及3个CAAT 盒。.综上所述，以上研究均围绕如何改善并提高东方肉座菌EU7-22纤维素酶酶活和酶解效率展开实验。同时敲除了ku70基因，获得了高效基因打靶系统受体菌株，为更好地研究纤维素酶系基因功能奠定基础。