双功能抗肿瘤多肽P2的作用机制研究

Anti-angiogenesis is an important method for inhibition of tumor growth. In the present project, an anti-tumor peptide (named P2) was designed based on its effects of anti-angiogenesis and inhibition of MMP-9 activity. Preliminary experimental works demonstrated that the newly designed peptide P2 can inhibit HUVEC proliferation, induce HUVEC apoptosis, inhibit angiogenesis in a CAM model, and significantly inhibit the growth of B10F16 cells and the corresponding angiogenesis in C57BL/6 mice. Based on these data, further works will be performed here to further investigate the mechanisms for P2 to inhibit tumor angiogenesis and tumor growth, which include the following works: 1. We will investigate whether the fluorescently labeled P2 can accumulate within the tumor tissue to confirm the tumor-targeting effect of P2; 2. We will test and compare the inhibitory effect of P2 on the activities of several tumor-related MMPs; 3. we will determine the molecular target of P2 on the cell surface of HUVECs; 4. We will investigate the molecular mechanism for P2 to inhibit HUVEC proliferation and to induce HUVEC apoptosis. These works focus on P2 and investigate its working mechanisms. The results will form a solid base for further research and development of P2 and provide a new idea about the design of new anti-tumor peptides.

抑制血管增生是抑制肿瘤生长的重要方法。本课题基于抑制血管增生和抑制基质金属蛋白酶-9酶活力两种机制，设计了双功能抗肿瘤多肽（命名为P2）。前期工作表明，P2可在体外抑制血管内皮细胞的增殖，促进血管内皮细胞的凋亡,在鸡胚尿囊膜模型上抑制血管增生，并在整体动物水平上抑制肿瘤部位血管增生和肿瘤生长。基于此，本课题将深入探讨P2抑制血管增生和肿瘤生长的机制，包括以下几个方面的研究：1.检测荧光标记的多肽P2是否可富集于肿瘤部位，验证其肿瘤靶向性；2.检测并比较P2对几种肿瘤相关的基质金属蛋白酶的抑制活力；3. 确定P2在血管内皮细胞上的作用靶点；4.揭示P2抑制血管内皮细胞增生和促进其凋亡的分子机理。这些工作以P2为研究对象，阐明其抗肿瘤的机制，为进一步研究、开发该多肽奠定了理论基础，同时为抗肿瘤多肽的设计提供了新的思路。

本课题在抑制血管增生多肽ES-2和基质金属蛋白酶-9酶抑制肽Inhibitor2的基础上设计了双功能多肽 P2。在此课题中我们对P2的抗肿瘤机制进行了研究。研究表明P2可抑制几种与肿瘤相关的基质金属蛋白酶的活力，这几种酶在肿瘤的发生发展中都起重要的作用。我们发现P2在体外对黑色素瘤细胞B16F10并无直接抑制作用。另外P2能有效抑制内皮细胞的迁移，增殖，促进内皮细胞的凋亡，从而抑制肿瘤血管生成达到抗肿瘤的效果。研究还确认了P2在内皮细胞上的作用靶点为整合素α5β1。我们对P2促进内皮细胞凋亡的机理做了初步的探讨，发现P2可诱导裂解型caspase3的出现，并可显著提高caspase 8的表达，并显著降低抗凋亡因子Bcl-XL的表达水平。我们制备了P2的多克隆抗体，完成了尾静脉注射和腹腔注射P2的小鼠血药浓度分析。另外针对多肽P2半衰期短的问题，我们对P2进行了PEG修饰，经修饰后P2的半衰期显著延长。P2的组成部分Inhibitor2为基质金属蛋白酶抑制剂，基质金属蛋白酶在炎症发展中起到重要作用。因此在基本完成项目计划的基础上，我们就P2对急性炎症模型内毒素休克的保护作用进行了研究。研究显示，尾静脉注射P2或腹腔注射P2均能对内毒素休克有效保护作用。经PEG修饰后P2的半衰期显著延长，其保护内毒素休克的效果也显著提高。另外PEG修饰后的P2对多发性硬化症小鼠模型有显著的保护作用。同时我们还研究了P2结构类似物CPU1，CPU2在炎症模型中的应用，在此研究中通过凝胶酶谱法证明了内毒素模型中小鼠血液中基质金属蛋白酶-8和-9瀑布式的释放，进一步阐明了内毒素模型的机理。上述研究成果对P2进一步的开发和应用奠定了基础，也对活性多肽的设计提出了新的思路。在本项研究中，发表SCI论文两篇，中文核心论文一篇，申请发明专利一项。培养毕业博士一名，硕士一名，在读硕士两名。