鸦胆子内生拟茎点霉属真菌Br11产抗病毒活性物质研究

The endophytic fungus Phomopsis sp. Br11 which metabolites showed significant inhibitory activity against the infection and the replication of Tobacco mosaic virus(TMV) had been isolated from Brucea javanica Merr. In this project, the antiviral substance will be separated from the metabolites of Br11, its effect on viral infection, multiplication, movement in the host plant and its induction of defense responses will be studied systematically by means of Western-blot, Northern-blot, Real-time Fluorescent Quantitative PCR, Green Fluorescent Protein (GFP) as molecular marker, as well as the optimization of its fermentation condition. These results will reveal the anti-TMV mechanism of the antiviral substance and lay a foundation for developing a new efficient and secure antiviral pesticide with chinese intellectual property rights.

Phomopsis sp. Br11是从具有抗病毒活性的苦木科植物鸦胆子中分离获得的一种拟茎点霉内生真菌，其代谢产物对烟草花叶病毒的侵染和复制均有强烈的抑制作用，本项目拟从该内生真菌的发酵液中分离纯化出抗病毒活性物质，采用单链构象多态性分析（SSCP）、Western-blot、Northern-blot、实时荧光定量PCR检测及绿色荧光蛋白标记等检测手段，从活性物质对病毒的侵染、病毒的增殖、病毒在寄主植物体内的移动及诱导寄主植物提高抗病毒能力4方面的作用机制入手，系统研究活性物质对病毒核酸序列、病毒基因的复制和表达、抗病毒物质的诱导等影响，全面揭示活性物质抗烟草花叶病毒的机制，并对该真菌产抗病毒活性物质的发酵条件进行优化，为研制高效、安全、具有自主知识产权的新型天然源抗病毒剂奠定基础。

从植物中分离筛选具有抗病毒活性的内生真菌，通过发酵工程技术大量生产抗病毒活性物质，是解决天然活性物质因资源短缺、合成困难、合成成本昂贵等制约其在生产上进一步应用的有效途径，也是新型安全高效抗病毒制剂研制最经济有效的途径。本项目采用形态学和分子生物学相结合的方法，对分离自苦木科植物鸦胆子中的内生真菌Br11进行了归属鉴定。从该真菌的发酵液中分别分离到一种对植物病毒增殖有抑制作用的化合物cytosporone U和一种对植物病毒侵染有抑制作用的胞外多糖(EPS)。并对它们的抗TMV作用机制和内生菌产抗病毒活性物质的适宜发酵条件进行了研究。结果表明EPS对TMV的侵染有很好的抑制效果，其抑制中浓度为1.08 μg/mL，可诱导烟草叶片中PR蛋白表达量和东莨菪苷含量的增加，使烟草植株产生抗病性； Cytosporone U对TMV的增殖有明显的抑制作用，其抑制中浓度为144.60 μg/mL，其不仅对TMV基因组RNA及亚基因RNA的合成具有显著的抑制，还可以抑制烟草中TMV CP蛋白的表达，阻碍TMV在烟草体内的扩散；内生菌Br11的最佳发酵条件为含有葡萄糖45.0 g/L、氯化铵4.5 g/L的查氏培养基，发酵温度26 ℃，初始pH值为6.0，转速为120 r/min。这些结果为内生菌Br11的进一步开发利用及新型天然源抗植物病毒剂的研制奠定了基础。