MiR23b介导L-精氨酸调控小肠黏膜上皮细胞热损伤中的自噬机制

Previous studies showed that the microcirculation ischemia of jejunum villus happened in both pig and rat in heat stress. The level of autophagy increased at the top of jejunum villus, miR-23b significantly decreased, and L-Arg relieve the thermal damage of small intestine. However, what is the target gene of autophagy in intestinal epithelial cell thermal damage and how miR23b regulates its predicted target gene and autophagy? How L-Arg relieves the injury of jejunum and regulates miR23b and autophagy? In response to these problems, this study used miRNA sponge, specific inhibit the expression of miR23b in epithelial cells of small intestine (IPEC-1/IEC-6). Integrated with deep sequencing data of heat stress, predicted the target gene—an autophagy related target gene ATG12-- of miR23b by target gene prediction software (miRDB/PICTAR) .Then verifies through the Luciferase Report Gene assay. This study copies the heat stress model and miR23b Inhibition heat stress model, observes the ultrastructure of autophagosome by microscope and TEM, detects LC3II, mTOR, Casp12 and others to evaluate the autophagy changes, explores the regulation of miR23b and related signaling pathways in the thermal damage, and studies the regulation of L-Arg on miR23b and autophagy in IPEC-1/IEC-6 in thermal damage. Finally, verifies the key target of autophagy in pigs in heat stress induced injury. The study aims to provide the theoretical basis of the mechanism of intestinal thermal damage.

前期研究表明热应激导致猪/大鼠空肠肠绒毛顶端缺血损伤，自噬水平升高，miR-23b显著下降， L-Arg可缓解动物肠道热损伤。MiR23b在热损伤中是否通过其靶基因对细胞自噬调控？L-Arg如何调控热损伤中自噬机制？针对上述问题，本项目采用miRNA海绵，特异性抑制小肠上皮细胞IPEC-1/IEC-6中miR23b表达，结合热应激深度测序数据，运用靶基因预测软件研究miR23b与自噬相关靶基因ATG12的关系，并通过荧光素酶报告基因验证。复制热应激模型及miR23b抑制热应激模型，光镜及电镜观察细胞形态及自噬体， LC3II，mTOR、Casp12等评价自噬变化，探讨miR23b对热损伤中靶基因与自噬的调节，对关键信号通路的调控；研究L-Arg对热损伤细胞miR23b的调控及对自噬的调控机制。通过靶动物回归实验，选择关键靶点在猪热应激试验中验证。本课题为缓解肠道热损伤机制提供新的理论支持。

动物夏季运输过程中受到高温、震动等多种因素刺激，导致机体全身血液再分配，肠道缺血，细胞外源供应受阻和营养受限。机体通过自噬实现细胞内能量再循环。本研究选择大鼠运输应激模型与大鼠IEC-6细胞热应激模型进行功能与机制的研究。探究L-Arg对热应激条件下细胞内miR23b及自噬的调控机制。本研究得出以下重要结果：1、大鼠在35℃，0.1g相对离心力震荡应激3天后，大鼠直肠温度、血清皮质醇含量及HSP27/70 mRNA表达均显著升高。小肠黏膜出现固有层裸露、上皮细胞核皱缩、内质网肿胀等结构改变。结果表明，运输应激导致小肠黏膜上皮损伤。基因芯片筛选差异基因结果显示，67个差异基因参与内质网未折叠蛋白应答，11个参与自噬调节，P53、MAPK和mTOR相关信号通路可能被激活。免疫组化和Western blot结果显示肠道上皮Casp3、Casp12和LC3表达量显著升高，mTOR和P-AKT含量下降。提示内质网应激诱导的自噬可能是损伤应答中的细胞存活机制。2、热应激后miR23b下调。报告基因试验验证UBE2O为miR23b的靶基因，并参与热应激的调控。深度测序结果显示，miR23b可能通过调控细胞泛素化水平影响细胞自噬，参与细胞应激调控。3、L-Arg对IEC-6细胞具有保护作用。结果显示，5mM L-Arg可显著激活热应激条件下IEC-6细胞自噬，提高热应激中的LC3、P62、UBE2O、UBE2R2、UBE2D1、UBR3等mRNA表达，降低Casp9的表达，且趋势与miR23b过表达组一致。提示L-Arg通过调控miR23b表达，缓解热应激所致的IEC-6细胞损伤。给大鼠连续7天补充L-Arg后进行运输应激。结果显示，与应激组比，补充L-Arg后大鼠体重有所升高，血清生化指标有所恢复，形态学观察显示，大鼠空肠黏膜屏障损伤减少，完整性提高，miR23b下降，自噬水平升高。提示L-精氨酸对大鼠小肠黏膜上皮的应激损伤有保护作用。. 本研究阐明miR23b在应激中对自噬的调节机制以及L-Arg是否通过调控miR23b缓解损伤等科学问题，从理论上深入研究热损伤机制与L-Arg调控的基础，为缓解家畜空肠黏膜热应激损伤提供新的理论依据。同时，miR23b的靶基因也可能成为应激营养调控中的关键靶点，为今后开发新的抗应激药物或添加剂提供潜在的应用价值。