西瓜低温诱导ClWRKY20转录因子的功能及耐低温机制研究

In our previous studies, 57 WRKY genes were found in watermelon plants .Expression profiles of 57 WRKY genes in response to cold stress were analyzed, and the cold-induced ClWRKY20 gene was selected as a candidate gene. In order to further study the gene function of ClWRKY20, this study intends to analyze the location of ClWRKY20 in the cell by the method of green fluorescent protein; to analyze the binding activity of ClWRKY20 and W-box by EMSA assay, and to verify the transcriptional activation activity by yeast one hybrid technique; the ClWRKY20 over-expression and RNAi transformation watermelon and Arabidopsis plants will be constructed, then the cold resistance ability of transgenic and non transgenic plants were compared; the response of the transgenic and non transgenic plants to ABA treatment was analyzed, and the expressions of the ABA-responsive genes, cold-responsive genes and the CBF family genes was investigated in the transgenic and non transgenic plants after cold. Through the above research, the aim of our project was to identify the function of the cold induced ClWRKY20 transcription factor, to study the regulation role of ClWRKY20 in cold-induced signal transduction pathways and whether it was involved in the ABA signaling pathway, which will help us to lay a good foundation for further understanding of watermelon chilling stress response mechanism.

前期研究中，我们共分离得到57条西瓜WRKY转录因子，对57个转录因子在低温下的动态表达进行分析，筛选到了显著响应低温胁迫的ClWRKY20转录因子。为进一步研究ClWRKY20的功能, 本项目拟通过GFP定位分析ClWRKY20在细胞中的位置；通过EMSA实验分析ClWRKY20与W-box的结合活性，并利用酵母单杂交技术进一步验证其转录激活活性；构建ClWRKY20基因的过表达载体和RNAi抑制表达载体，分别转化拟南芥和西瓜，比较野生型和转基因植株的抗冷能力；分析ClWRKY20对ABA的响应，及下游部分低温信号转导通路基因、CBF家族基因、ABA应答基因表达的影响。通过以上研究，确定冷诱导ClWRKY20转录因子的功能，探讨ClWRKY20在低温胁迫信号转导途径中的调控作用以及是否参与ABA信号途径，为进一步深入认识西瓜低温胁迫应答机制提供线索。

西瓜是世界各地人们最喜爱的水果之一，也是我国重要的经济作物，低温弱光是限制西瓜早春栽培的重要因素。本项目主要是对西瓜ClWRKY20转录因子在西瓜低温抗性中的调控作用进行研究。首先利用RT-PCR的方法将其从叶片中克隆出来，并进行生物信息学分析，ClWRKY20属于WRKY基因家族中的第三类转录因子，具有典型的第三类WRKY转录因子特征，含有一个WRKY保守域，其锌指结构类型为C2HC型；其表达受低温、干旱、高盐和各种激素诱导，其在西瓜的根、茎、叶组织中均有表达，但是在叶片中表达量最高；构建该基因同绿色荧光蛋白（GFP）的融合表达载体，检测该蛋白在烟草下表皮细胞中的定位情况，发现该蛋白定位于细胞核中；构建该基因的过量表达载体，通过花序侵染法转入拟南芥中，得到纯合的ClWRKY20过量表达植株；对转基因植株进行低温处理，ClWRKY20过量表达植株的抗冻表型非常明显，同时对抗逆相关生理指标FV/FM、电导率、MDA和脯氨酸进行测量发现，转基因植株的电导率和MDA含量明显的低于野生型植株，这说明同野生型相比，转基因植株的细胞损伤程度明显的降低。低温处理后转基因植株的脯氨酸含量比野生型的要高，FV/FM降低程度明显的低于野生型植株。这些数值充分地说明了将ClWRKY20导入到拟南芥植株中以后可以明显的提高其对低温的耐受能力，ClWRKY20是西瓜低温抗性的正向调控因子。通过测量种子萌发率和根系长度发现，转基因植株在盐胁迫条件下的种子萌发率和根系长度也明显高于对照，转基因植株抗盐表型明显，生理指标（电导率、MDA和脯氨酸）测定也表明其耐盐能力得到了明显的提高，这些结果说明过表达ClWRKY20基因显著地提高了拟南芥植株的盐胁迫抗性。