西瓜低温诱导转录因子ClMYB的功能鉴定及其调控机制解析

Low temperature is one of the major limiting factors in watermelon production in early Spring. Transcription factors in MYB family extensively participate in the responses to abiotic stresses in plants. In our previous work, 154 transcription factors in MYB family were identified on watermelon genome. Of them, 88 MYB genes belong to the R2R3 type and their responses to low temperature stress were analyzed in watermelon. Expression level of a MYB gene (which was temporarily named as ClMYB) was found to be upregulated under low temperature stress. Significant expression levels were also observed for ClMYB between the tolerant and susceptible genotypes under low temperature stress. Those results suggested the potential function of low temperature for ClMYB gene. Based on these data, in the present project we will firstly identify the fundamental characteristics of ClMYB as a transcription factor. Then, transformation of tobacco and wild watermelon will be conducted to validate the function of low temperature tolerance for ClMYB. Meanwhile, RNA-seq, EMSA, and yeast hybrid system will be used to indentify the target genes of ClMYB. At last, physiological measurement with regard to some metabolic pathways involving the differentially expressed genes will be carried out. The current project is an extension of our earlier work. It will lay theoretical groundwork for deciphering the mechanisms of action on ClMYB, tapping its target genes, and setting up a low temperature stress-responsive network using ClMYB as a node. Furthermore, it will provide valuable gene resource for innovation of watermelon germplasm with low temperature tolerance.

低温是西瓜早春生产中的主要非生物限制因子，MYB转录因子广泛地参与了植物对逆境胁迫的响应。在前期的研究中，我们在西瓜全基因组上鉴定出154个MYB家族转录因子，分析了其中88个R2R3类MYB转录因子对低温胁迫的响应，发现一个转录因子（暂称为ClMYB）受诱导上调表达，并在耐低温和低温敏感材料之间存在着显著的差异，推测该转录因子与西瓜耐低温性状有关，我们克隆了该转录因子。在此基础上，本项目拟首先分析ClMYB转录因子的基本特征；分别转化烟草和野生西瓜验证其耐低温功能；然后利用RNA-seq、凝胶阻滞分析和酵母单杂等手段，发掘ClMYB调控的靶基因，分析其作用的分子和生理机制。本项目是已有研究的深入和延续，研究结果将为西瓜耐低温种质创新提供重要的基因资源，同时也为解析以ClMYB转录因子为节点的低温胁迫应答网络提供理论依据。

低温是影响早春西瓜生长的主要环境因子之一。MYB家族转录因子广泛参与了植物对逆境响应的调控。而MYB是否参与了西瓜对低温胁迫的调控，以及是如何调控的，目前尚不清楚。针对这一问题，本课题首先对低温胁迫下的西瓜叶片进行了转录组分析，鉴定出763~4135个差异表达基因。时间序列分析表明这些基因主要有4种响应模式，分别是持续降低、低-高，高-低和低-高-低，基因功能主要富集在调控和次生代谢。在西瓜基因组中鉴定出89个R2R3-MYB基因，包括48个复制基因对，片段复制和转座复制是该家族基因的主要扩增模式。复制基因都受到了纯化选择，并且在基因结构、顺式作用原件、基因表达模式等方面表现出了一定的多样性。仅一个复制基因对Cla005982-Cla007586在西瓜低温胁迫时同时表现为差异表达。为进一步分析该复制基因对的功能，本课题克隆了Cla007586基因，亚细胞定位发现其位于细胞核并具有转录活性。构建了Cla007586基因的超表达载体，并对烟草进行了遗传转化。与野生型相比，转基因烟草植株在4℃低温下叶片表现出更高的萎蔫指数，且细胞膜损伤程度、膜脂过氧化程度均高于野生型烟草植株，表现为对低温胁迫更为敏感。对烟草中非生物胁迫响应的标记基因的表达分析表明，过表达Cla007586基因抑制了ABA、亲水性蛋白和脯氨酸等合成途径上相关基因的表达，从而增加了转基因烟草植株对低温的敏感性。构建了西瓜低温胁迫下叶片cDNA均一化文库，利用酵母双杂交方法筛选出了13个与Cla007586互作的蛋白，进一步验证了ω-3脂肪酸去饱和酶Cla004356和热激转录因子Cla016764与Cla007586的互作，而这2个互作基因在西瓜低温胁迫早期都被诱导上调表达，表明其可能与Cla007586互作调控下游基因表达实现对低温胁迫的响应。本项目解析了西瓜对低温胁迫的响应，分析了R2R3-MYB家族基因的复制模式，鉴定了复制基因Cla007586的功能和可能的调控途径，研究结果不仅为西瓜提高耐低温性遗传改良提供了基因资源和理论依据，同时还为复制基因的功能研究提供了资料支撑。