PI3K/Akt/mTOR介导的血管内皮细胞自噬在激素性骨坏死中的作用及其mTOR-siRNA对其影响的实验研究

Steroid-induced avascular necrosis of femoral head (SANFH) has a complex biological process, its pathogenesis remains unclear. Our preliminary findings indicate that SANFH association with vascular endothelial cells(VEC) injury,differences in gene expression and autophagy of osteocyte.But the regulation mechanism between VEC and autophagy is not clear. The issue based on the previous study, researching endothelial cells autophagy in the blood vessel of femoral head, through cell culture and animal models, detecting emodynamic changes by MSCT, observing VEC autophagy by immunofluorescence and scanning electron microscopy, using RT-PCR and Western blotting method to detect mRNA and protein expression of Beclin1 ,MAP1LC3, PI3KI, mTOR,and Akt, analyzing correlation of autophagy, VEC dysfunction, hemodynamic changes , PI3K / Akt / mTOR regulation, mTOR-siRNA interference, study the role of VEC autophagy regulation in SANFH, and in order to discuss the pathogenesis and prevention of SANFH.

肾上腺皮质激素引起的股骨头缺血坏死(SANFH)具有复杂的生物学过程，其发病机制仍不清楚。我们的前期研究结果表明:血管内皮细胞损伤、差异表达基因的调控以及骨细胞自噬参与了SANFH的发病过程。但血管内皮细胞与自噬之间的关系及调控机制尚不明确。本项目拟在前期研究基础上，以股骨头供血血管的内皮细胞自噬为切入点，通过动物模型及细胞培养，应用MSCT检测血流动力学改变，利用免疫荧光标记和扫描电镜观察血管内皮细胞自噬；利用RT-PCR、Western blotting方法检测Beclin1、MAP1LC3、PI3KI、mTOR、Akt的mRNA与蛋白表达；并分析自噬、血管内皮细胞功能障碍、血流动力学变化、PI3K/Akt/mTOR调控、mTOR-siRNA干扰与SANFH之间的相关性，探讨血管内皮细胞自噬调控在SANFH中的作用，为探索SANFH的发病机理及防治开辟新的思路。

研究背景：肾上腺皮质激素引起的股骨头缺血坏死(SANFH)具有复杂的生物学过程，其发病机制仍不清楚。我们的前期研究结果表明:血管内皮细胞损伤、差异表达基因的调控以及骨细胞自噬参与了SANFH的发病过程。但血管内皮细胞与自噬之间的关系及调控机制尚不明确。研究内容：本课题采用建立SANFH动物模型和体外培养VEC的方法进行实验研究，应用MSCT检测血流动力学改变，利用免疫荧光标记和扫描电镜观察血管内皮细胞自噬；利用RT-PCR、Western blotting方法检测Beclin1、MAP1LC3、PI3KI、mTOR、Akt的mRNA与蛋白表达；并分析自噬、血管内皮细胞功能障碍、血流动力学变化、PI3K/Akt/mTOR调控、mTOR-siRNA干扰与SANFH之间的相关性，探讨血管内皮细胞自噬调控在SANFH中的作用。研究结果：(1)激素导致的VEC自噬异常与SANFH的发病存在相关性；(2)在SANFH的发生过程中，随着作用时间的增加，激素通过促进股骨头VEC的PI3K/Akt/mTOR信号通路相关因子表达增高和Beclin1 、MAP1LC3表达降低，抑制了生理性自噬对VEC的保护作用，导致VEC损伤，最终可能导致了SANFH；(3)在SANFH的发生过程中，mTOR-shRNA可通过抑制mTOR并阻断PI3K/Akt/mTOR信号通路，从而增强自噬，修复VEC损伤，可能修复或缓解SANFH。科学意义：SANFH具有复杂的生物学过程，其发病机制至今未明，临床上缺乏行之有效的治疗手段，探明SANFH的病因学机制，早期诊断与治疗仍然是该领域研究的重要内容。如果在早期阶段进行有效干预治疗，将有可能终止坏死的进程，避免进一步发展导致股骨头的塌陷。因此，尽量在股骨头塌陷之前，通过改善股骨头的血供，促进骨修复和再生，本研究为SANFH干预性治疗治疗提供了新的思路与靶点。