血浆D-dimer检测恶性肿瘤血行微转移的临床价值评估及机制研究

Metastasis remains the major cause of cancer treatment failure, Circulating Tumor Cells(CTCs) heterogeneity has limited the clinical application of traditional methods. In our previous study, we found plasma D-dimer levels elevated in metastasis caner patients and showed a linear association with CTCs. Additionally, expression of MT1-MMP in CTCs may play an essential role in D-dimer generating in microenvironment. So we hypothesize that plasma D-dimer levels are elevated after CTCs clot formation and is an essential accompaniment of CTCs, it can be used to identify patients with micro-hematogenous metastasis. Based on previous studies, we designed this multiple-part experimental study to explore the effectiveness of managing suspected metastasis using plasma D-dimer testing in clinical cancer patients, and found the related mechanism in vivo, also by bioinformatics technology. In this study, we will collect blood and tissue samples from cancer patients with a follow-up study to evaluated the clinical use of D-dimer in detecting hematogenous metastasis and compared with Cellsearch®CTC method. Then, we will construct in vivo hematogenous metastasis model after transfect p-EGFP vector to B16/F10 melanoma cells and other tumor cells, thereafter, we will detect the change of plasma D-dimer levels in micro-hematogenous metastasis model. Additional, we will explore related mechanism of D-dimer generating by MT1-MMP though protein microarry technology and prove it. The propose of this study is to identify a factor which is not only effective but also rapid, ease of measurement, non-invasion and the low cost for predict micro-metastasis in cancer patients.

血行微转移是肿瘤治疗失败的主要原因，循环肿瘤细胞（CTCs）异质性导致目前检测手段存在缺陷。我们前期研究发现血浆D-dimer与血行转移关系密切，且与CTCs检测正相关；基质金属蛋白酶MT1-MMP可能是影响CTCs作用微环境产生D-dimer的重要原因。我们假设，肿瘤患者血浆D-dimer升高与CTCs形成的微血栓有关，是CTCs作用机体微环境产生的关键伴随物，可用于检测血行微转移。本实验拟通过临床检测评价D-dimer诊断血行转移的价值、体内外实验揭示其升高机制。通过Cellsearch®-CTC等检测患者血液标本并随访比较其诊断效率；建立血行转移模型并检测D-dimer的变化，利用蛋白抗体芯片筛选与MT1-MMP作用导致D-dimer改变的相关因子，绘制网络图并验证。D-dimer作为一种无创、廉价、快速的检测方法，拟通过本研究为它在恶性肿瘤血行微转移及常规筛查方面的应用提供依据。

血行微转移是肿瘤治疗失败的主要原因，循环肿瘤细胞（CTCs）异质性导致目前CTCs检测手段存在缺陷。我们前期临床研究发现恶性肿瘤患者血浆D-dimer的水平与血行转移关系密切，且与部分患者检测的CTCs检测结果呈正相关，因此我们考虑肿瘤患者血浆D-dimer升高可能与CTCs形成的微血栓有关，可能可用于检测肿瘤患者的血行微转移；此外基质金属蛋白酶MT1-MMP可能是影响CTCs作用微环境导致血浆D-dimer升高的重要原因。本实验一方面通过大规模临床检测评价D-dimer诊断血行转移的价值，通过阳性富集Cellsearch®-CTC、阴性富集利用差减富集技术与免疫荧光染色-染色体荧光原位杂交技术检测患者血液标本CTCs水平,同时收集血浆D-dimer，肿瘤标志物等检测指标并进行随访，证实D-dimer与CTCs的正相关性，并且证实D-dimer与CTCs、影像学以及病理学检测比较是评价转移和预后的最佳指标（部分结果已发表）；另一方面通过体内外实验揭示其升高的机制，利用恶性黑色素瘤B16等肿瘤细胞进行体内外实验，建立动物血行转移模型，证实敲除MT1-MMP后肿瘤血行转移明显降低且伴随D-dimer降低，同时成功构建三维体外血行转移模型通过激光共聚焦进行直接观察肿瘤细胞进入血管在初始状态下微血栓的形成粘附情况以及与MT1-MMP的关系以及对 D-dimer的影响。证实敲除MT1-MMP可以导致细胞的转移失败以及较少的细胞停留在血管上，D-dimer的产生减少；进一步利用蛋白组学研究筛选与MT1-MMP作用导致D-dimer改变的相关因子，绘制网络图验证（动物实验结果审稿中拟今年发表）。通过本项研究证实恶性肿瘤血浆D-dimer与循环肿瘤细胞（CTCs）形成的微血栓出现的互应关系，是CTCs存活过程中作用机体微环境产生的关键伴随物，为D-dimer临床检测肿瘤血行微转移提供科学依据。揭示CTCs表面高表达MT1-MMP是最终导致D-dimer的增高的主要原因，为针对肿瘤细胞血行转移的临床检测及分子靶向治疗提供依据。验证血浆D-dimer与CellSearch® CTC等检测相比是一种有效、快速、廉价、易测的因子，可以考虑应用在恶性肿瘤患者是否出现血行转移的临床初步筛查中，以及医疗设施较差的基层医院，减轻国家及患者的经济负担。