临床耐药菌株碳青霉烯酶新基因的克隆、功能及遗传环境研究

碳青霉烯类抗生素是治疗产超广谱β-内酰胺酶和AmpC酶多重耐药肠杆菌科细菌感染的最有效药物。然而，产NDM、KPC等碳青霉烯酶"超级细菌"的出现和播散，对临床抗菌治疗及医院感染控制提出严峻挑战。细菌产碳青霉烯酶的类别多，目前已发现3大类约20个亚类，但国际上每年仍有多个新碳青霉烯酶被发现。在申请人及课题组前期发现新耐药基因qnrC及vanM的基础上，本研究拟对具有产碳青霉烯酶表型而基因型未知的肠杆菌科临床耐药株进行下列研究：①采用接合实验、质粒酶切、克隆新耐药基因；②测定耐药基因周边DNA序列，通过同源性分析、进化分析、插入序列搜索等方法明确基因环境及可传播性；③通过酶动力学检测、等电点分析了解新碳青霉烯酶功能特性，并用定点突变方法结合蛋白结构预测，明确新耐药蛋白的活性位点和关键功能域。这对揭示临床菌株对碳青霉烯类耐药新机制，及早发现和监控潜在"超级"耐药细菌，具有重要科学意义和社会效益。

肠杆菌科临床株对超广谱β-内酰胺类、碳青霉烯类药物耐药性的日益增长是中国乃至全球面临的严重问题。研究本地区临床菌株对碳青霉烯类等β-内酰胺类的耐药机制，探索可能存在的新的耐药基因，可以及早发现和监控潜在"超级"耐药细菌。本项目对我院多年保留的碳青霉烯类等β-内酰胺类耐药菌株进行耐药机制的研究，发现一些β-内酰胺酶亚型或罕见基因型，对其基因遗传环境、功能特征、传播机制等方面进行研究。研究发现新的超广谱β-内酰胺酶亚型CTX-M-125，该酶与CTX-M-14的同源性最高，氨基酸第274位发生改变（S274H）,能够水解头孢噻肟、头孢他啶等第3代头孢菌素。遗传环境分析表明blaCTX-M-125基因位于IncN质粒上，其上、下游分别存在插入序列，提示具有潜在的水平传递能力。该基因能通过接合及转化实验传递给受体菌株，在我院阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌中均有发现。对本所发现的碳青霉烯酶新亚型IMP-23研究表明，该IMP型金属酶，其氨基酸和核苷酸序列与IMP-8相似度最高，仅有1个氨基酸改变（V49F），对亚胺培南、美罗培南、厄他培南等碳青霉烯类水解活性较低。本次克隆到7050bp 长的blaIMP-23基因的片段，分析表明blaIMP-23基因由1类整合子携带，其上游存在Tn1696-like转座子，下游为氨基糖苷类钝化酶基因aac(6')-Ib和转座酶相关基因，提示该耐药基因具有潜在的水平传递能力。但该基因不能通过接合或转化实验传递给受体菌株，推测位于染色体上。此外，课题组首次在肺炎克雷伯菌、产气肠杆菌中克隆到国际罕见超广谱β-内酰胺酶SFO-1，并完成SFO-1携带质粒的全基因组测序，证实在肺炎克雷伯菌、产气肠杆菌和阴沟肠杆菌中含有骨架及内容高度相似的blaSFO质粒，揭示blaSFO-1基因在3种细菌中的播散源于该多重耐药质粒的水平传播。发现产SFO-1超广谱酶的肺炎克雷伯菌属于ST11型国际优势流行克隆，也是中国的主流克隆。追踪产SFO-1菌株起源发现，产SFO-1的ST11克隆早在2006年已在我院临床菌株中出现，并存在克隆传播。鉴于SFO-1超广谱酶基因已被多重耐药质粒捕获，在多种属间成功传播，并被肺炎克雷伯菌优势克隆获取，在本地医院临床菌株中通过克隆传播与水平传播等途径播散，亟待引起重视，预防和控制相关质粒或菌株引发的医院感染的暴发和流行。