泥鳅Gapdh影响Elovl2和Elovl5在高度不饱和脂肪酸合成中互作的分子机制

Investigating the molecular mechanism of highly unsaturated fatty acids (HUFA) biosynthesis in fish is the basis for regulating the ability of HUFA biosynthesis, which is very meaningful for increasing nutritional quality of seafood. Elongation of long-chain fatty acids 2 (Elovl2) and Elovl5 play an important role in HUFA biosynthesis. Our previous works found that there is an interaction between elovl2 and elovl5 on HUFA biosynthesis in loach (Misgurnus anguillicaudatus). A gene named gapdh which interacted with both elovl2 and elovl5, was screened out by using yeast two hybrid system. However, gapdh impacts interactions of elovl2 and elovl5 on HUFA biosynthesis in loach are unknown. In this project based on our previous works, first, we plan to confirm the interactions of elovl2 and elovl5 are affected by gapdh in loach by overexpression and knockdown of gapdh in cell line. And then, we will identify the interactions of elovl2 and elovl5 are affected gapdh in loach post-translational modification using yeast two hybrid, in vitro phosphorylation assay. Last, we will reveal the functional mechanism of gapdh on interaction of elovl2 and elovl5 in HUFA biosynthesis using gapdh-/- fish. The functional characterization of the elovl2 and elovl5 genes will not only make great contributions to comprehensively understanding the mechanism of regulating HUFA biosynthesis, but also provide a novel strategy for improving the n-3 HUFA contents of freshwater fish.

了解淡水鱼类高度不饱和脂肪酸（HUFA）合成的分子机理是调控淡水养殖鱼类自身HUFA合成能力的前提，对提高水产品营养品质具有重要的意义。延长酶2（Elovl2）和Elovl5在HUFA合成中起着重要作用。申请人在前期研究中发现泥鳅Elovl2和Elovl5存在互作关系（简写为Elovl2-5），并筛选出一个与这两个基因共同互作基因-甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Gapdh），然而泥鳅Gapdh如何在HUFA中影响Elovl2-5尚不清楚。本项目拟利用过表达和敲降在转录水平研究泥鳅Gapdh对Elovl2-5的影响；再利用酵母双杂交和体外磷酸化实验等，研究在蛋白翻译后修饰泥鳅Gapdh与Elovl2/5互作的关系；最后构建Gapdh-/-泥鳅，研究Gapdh缺失对Elovl2-5的影响。本项目不仅将丰富人们对鱼类Elovl2-5在HUFA合成中的认识，还将为提高淡水养殖鱼HUFA合成能力奠定基础。

高度不饱和脂肪酸与人类健康密切相关。淡水鱼Elovl2和Elovl5基因在HUFA合成中起着重要作用。本项目按照计划研究内容，研究泥鳅和斑马鱼Gapdh对Elovl2和Elovl5在HUFA合成中的作用影响，明确Elovl2和Elovl5在HUFA合成中的互作关系，揭示淡水鱼Elovl2和Elovl5在HUFA合成中的互作机制。主要结果如下：1）基于体外酵母表达系统研究泥鳅Elovl2和Elovl5在HUFA合成的作用，发现泥鳅Elovl2和Elovl5分别具有延长C18-22和C18-20不饱和脂肪酸的能力；2）构建完成泥鳅酵母双杂交文库构建，筛选出泥鳅GAPDH可能与Elovl2和Elovl5在HUFA合成中的相互作用；3）成功构建泥鳅Gapdh突变体，但是发现泥鳅Gapdh纯合致死，无法开展计划实验。因此采用敲降技术，构建斑马鱼ZFL Gapdh敲降模型；4）研究Gapdh敲降对HUFA合成的影响，发现敲降gapdh后，DHA的含量显著降低；5）基于磷酸化蛋白质组学探究Gapdh参与HUFA合成中的关键通路与蛋白，发现GSK3BY216位点的磷酸化会降低Elovl2、ELOVL5和FADS2在HUFA合成中发挥重要作用基因的表达水平。抑制GSK3BY216位点的磷酸化提升DHA含量；6）研究了WT和elovl2-/-斑马鱼的肝脏转录组谱，筛选出关键基因和通路，构建Elovl2在HUFA合成中的作用网络；7）基于转录组探究elovl5缺失提升HUFA合成的关键通路与基因；8）探究体外添加不同比例ALA/LA对elovl5在HUFA合成作用的影响，发现敲降elovl5组HUFA含量均随着添加ALA/LA比例增大而升高；9）在活体水平开展探究不同ALA/LA比例饲料对elovl5在HUFA合成中的作用，结果发现饲料ALA/LA比例为2:1时，HUFA合成能力最强；10）在以上实验结果发现，发现ELovl5也影响Fads2表达，通过不同ALA/LA饲料投喂探究斑马鱼elovl5和fads2在HUFA合成中的相互作用，发现Fads2对Elovl5缺失导致的HUFA升高至关重要。本项目研究结果为淡水鱼Elovl2和Elovl5在HUFA合成中的互作作用提供基础证据，为提高淡水鱼自身HUFA合成能力奠定了基础。