泥鳅去饱和酶基因（fads）在高度不饱和脂肪酸合成中的作用机制

Investigating the molecular mechanism of highly unsaturated fatty acids (HUFA) biosynthesis in fish is the basis for regulating the ability of HUFA biosynthesis, which is very meaningful for increasing nutritional quality of seafood. Fatty acid desaturase (fad) genes play an important role in HUFA biosynthesis. Our previous works detected that loach (Misgurnus anguillicaudatus) has an ability of HUFA biosynthesis with three fad genes. However, their regulation functions on HUFA biosynthesis are unknown. In this project based on our previous works, first, we plan to confirm the functional characterizations of three fads genes using transgenic yeast expressing method. And then, we will construct three fads-deficiency loach and fads-overexpression loach, respectively, to identify the key genes and metabolites of three fads by the comparative sequencing analysis and metabonomics profiles, respectively. Moreover, we will study the key genes and interacting proteins of three fads genes in cell line using biochemical analysis, including Co-IP, western blot and immunofluorescence technique, to uncover the molecular mechanism of fads genes for regulating HUFA biosynthesis. Last, we will reveal the functional mechanism of fad on HUFA biosynthesis in fish fed with stable isotope labeling fatty acids substrates diets. The functional characterization of the three fad genes will not only make great contributions to comprehensively understanding the mechanism of regulating HUFA biosynthesis, but also provide a novel strategy for improving the nutritional quality of freshwater fish, which is significance in both theory and application.

了解鱼类高度不饱和脂肪酸（HUFA）合成的分子机理是调控鱼类自身合成HUFA能力的前提，对提高水产品的营养品质有重要的意义。去饱和酶（fads）基因在HUFA合成中起着重要作用。申请人在前期研究中已经证实泥鳅具有很强的HUFA合成能力，其具有三条fads基因，但它们的作用机制尚不清楚。本项目在前期研究基础上，拟先用体外酵母表达明确这三条fads的生物学功能；再分别构建三条fad敲除泥鳅和fads过表达泥鳅，基于转录组和代谢组学手段，确定与fads作用的关键基因和代谢产物，再在细胞水平采用免疫共沉淀、Western blot等筛选出互作蛋白并验证，来剖析三条fads基因在HUFA合成中的作用机制；最后通过投喂稳定同位素标记饲料，揭示fads基因在不同底物下的作用机制。本研究不仅将丰富人们对鱼类fads在HUFA中作用机制的认识，还将为提高淡水鱼营养品质提供新线索，在理论和应用均具有重要意义。

高度不饱和脂肪酸（HUFA）与人类健康密切相关。淡水鱼去饱和酶（fads）基因在HUFA合成中起着重要作用。本项目按照计划研究内容，先用体外酵母表达明确这三条fads的生物学功能；再构建fads敲除和fads过表达模型，基于转录组手段，确定与fads作用的关键基因和蛋白，以及作用网络等；最后通过投喂不同脂肪源饲料，揭示fads基因在不同底物下的作用机制。主要结果如下：1）克隆出泥鳅fads1a、fads1b和fads2基因的cDNA全长，分析了泥鳅fads基因的分子结构，明确了泥鳅fads1a基因和泥鳅fads1b基因分子结构相似，但是与fads2有明显差异。2）采用体外酵母表达系统，确定了泥鳅fads1基因在HUFA合成中没有去饱和酶活性。3）构建完成过表达fads2泥鳅和斑马鱼模型。4）以斑马鱼为研究对象，成功构建了斑马鱼fads2基因敲除模型（fads2-/-），为揭示淡水鱼fads2在HUFA合成中的作用机制奠定了基础。 5）对野生型（WT）和fads2-/-进行了肝脂质组学分析。斑马鱼fads2缺失显著提升了斑马鱼肝脏FFA18:2n-6、FFA18:1n-9及FFA20:5n-3含量。同时，显著降低了FFA22:6n-3含量。6）通过转录组和蛋白组结合技术，筛选出fads2在HUFA合成中的关键基因和蛋白，并鉴定出fads在HUFA合成中的主要信号通路。7）采用磷酸化蛋白质组学技术探究了fads2在HUFA合成中的磷酸化蛋白质、磷酸化位点以及作用网络。8）通过投喂实验，明确了饲料中添加1.3%亚油酸可提高泥鳅生长性能。随饲料中亚油酸水平的升高，泥鳅肝脏中fads2基因的表达水平升高。通过不同脂肪源对fads2缺失斑马鱼的投喂实验发现，fads2缺失显著降低了牛油组、大豆油组及棕榈油组鱼体HUFA含量，然而投喂鱼油饲料没有显著降低HUFA含量。9）泥鳅fads6编码的氨基酸序列缺失细胞色素b5结构域和组氨酸功能域，推测泥鳅fads6基因编码蛋白不具备去饱和活性。10）构建了斑马鱼fads6缺失模型，发现了fads6基因翻译产生的蛋白可能主要以C18:3n-6和C20:2n-6为底物质发挥去饱和酶的作用。本项目研究结果为淡水鱼fads在HUFA合成中的作用提供基础证据，同时也为通过调控fads2表达，提高淡水鱼自身HUFA合成能力的新途径奠定了基础。