动物须毛癣菌角蛋白酶基因的敲除与致病功能分析

皮毛动物养殖是我国畜牧业重要组成部分，须毛癣菌作为主要的皮毛动物癣病致病真菌，会造成裘皮生产业的巨大损失，深入揭示该病原的致病机理对动物健康与行业发展具有重要意义。角蛋白酶是毛癣菌主要致病因子，是真菌破坏机体防御屏障的关键因素，决定着病原致病性的强弱，但目前仍不清楚的是：毛癣菌角蛋白酶的决定基因的确切定位，其改变将如何影响角蛋白酶活性与病原的致病性？为了确定须毛癣菌角蛋白酶基因，探讨角蛋白酶基因参与致病的机制，申请人将通过ATMT系统遗传转化须毛癣菌，把抗性T-DNA同源重组插入菌体基因组，引发菌株定点突变，实现对角蛋白酶基因的定位与敲除。对基因敲除株进行基因、表型、致病特征与角蛋白酶活性的分析比对，寻找其中的变化规律。从而在须毛癣菌基因组中锁定角蛋白酶基因位置，明确这些基因对角蛋白酶活性的调控功能与对病原致病性的影响规律，为进一步揭示真菌致病机理、研制高效真菌疫苗、服务临床奠定基础。

须癣毛癣菌（Trichophyton mentagrophytes）是常见的人畜共患皮肤真菌病病原，能引起严重的皮肤感染。金属蛋白酶（MEP）作为角蛋白酶的主要组成部分，被认为是须癣毛癣菌入侵机体过程中的重要毒力因子和营养因子，相应基因的缺失可能对须癣毛癣菌的毒力产生一定影响。本研究中根据须癣毛癣菌5个MEP基因片段设计引物高保真扩增，引入潮霉素抗性基因（hph）片段构建5个基因敲除用双元载体。通过根癌农杆菌介导的转化体系（ATMT）分别对须癣毛癣菌5个MEP基因进行定位与敲除。得到稳定的基因敲除株后，首先使用人粗制角蛋白作为诱导，对比须癣毛癣菌MEPs基因转化株和标准株对于角蛋白的消化能力；随后使用上述各菌株对人发和犬毛、狐狸毛、猫毛、豚鼠毛等5种毛发进行穿孔试验；最后使用上述菌株接种豚鼠皮肤，通过砂纸法建立须癣毛癣菌感染模型。上述三项毒力试验的结果提示，须癣毛癣菌MEPs基因缺失会对其蛋白消化能力和致病性造成影响。在须癣毛癣菌分泌金属蛋白酶参与致病的过程中，MEP4与MEP5基因可能起到了关键作用，而MEP3基因的功能相对较弱。本研究有助于阐明须癣毛癣菌的致病机制及金属蛋白酶在致病过程中发挥的作用。