须癣毛癣菌ZafA基因的锌转运调节作用与毒力功能研究

Dermatosis is one of the most common diseases seen in large scale danimal fur farms. Among which Trichophyton mentagrophytes caused animal dermatophytoses are the most common, and can cause huge economic loss. Understand the molecular level of Trichophyton mentagrophytes and unravel its pathogenic mechanism is important for the development of effective disease prevention and control, which has great significance for the fur industry. Zinc is an essential element in the growth of this pathogen. It can bind with multifunctional protein, thus affect the expressions of fungal growth and virulence. Studies have shown that Zinc-responsive Actiating Factor (ZafA) can adjust zinc uptake in a low zinc environment, which allows the fungi to obtain zinc from the host as part of the invasion process and at the same time nurture itself. However, the function of Trichophyton mentagrophytes ZafA gene is still not clear. This research will use Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation system obtain ZafA transformation strain and ZafA reduction strain, and perform low zinc tolerance test, zinc uptake test and skin inoculation test on these transformed and reduced strains together with ZafA standard strain to evaluate the effect of ZafA on zinc transport regulation and virulence of Trichophyton mentagrophytes. Thus, clearify the functions of Trichophyton mentagrophytes ZafA gene, which can further reveal the pathogenesis of this pathogen.

皮肤病是规模化毛皮动物饲养场的常见疾病，其中由须癣毛癣菌引起的动物皮肤癣菌病占很大比重，可造成巨大的经济损失，深入揭示须癣毛癣菌的分子致病机制对该病的有效防控以及行业的发展意义重大。锌作为致病真菌生长的必需元素，能够通过与多种功能蛋白结合，深度影响真菌的生长性能和毒力表达。研究表明，锌响应活力因子（ZafA）可以调节致病真菌在低锌环境中的锌摄取能力，有助于从机体组织中获取锌元素，从而达到其营养自身和入侵机体的目的。但目前须癣毛癣菌ZafA基因的功能尚不明确，本项目将通过根癌农杆菌介导的遗传转化系统得到ZafA基因转化株和ZafA基因还原株，并将上述菌株同标准株一起进行低锌耐受试验、锌摄取能力测定试验及皮肤接种试验，综合评价ZafA对于须癣毛癣菌锌转运调节能力和毒力的影响，以明确须癣毛癣菌ZafA基因的相关功能，为进一步揭示该病原菌的致病机理奠定基础。

皮肤病是规模化毛皮动物饲养场的常见疾病，其中由须癣毛癣菌引起的动物皮肤癣菌病占很大比重，可造成巨大的经济损失，深入揭示须癣毛癣菌的分子致病机制对该病的有效防控以及行业的发展意义重大。锌作为致病真菌生长的必需元素，能够通过与多种功能蛋白结合，深度影响真菌的生长性能和毒力表达。研究发现多种真菌的锌响应活力因子的基因组成具有一定的相似性，初期试验，以烟曲霉锌响应活力因子的基因序列为基础设计引物，以须癣毛癣菌全基因组DNA、cDNA为模板进行PCR扩增，经过多次试验发现无法获得须癣毛癣菌锌响应活力因子的基因组成。. 因此，我们首次使用Illumina HiSeqTM 2000技术对正常状态下及锌缺乏情况下的须癣毛癣菌进行了转录组测序，并对测序数据进行了从头组装、基因功能注释以及基因的差异表达分析等，共获得10751个unigenes，89％以上的基因得到功能注释。通过本次测序，本研究首次确定了锌缺乏对须癣毛癣菌基因表达的影响。这些测序以及功能注释信息为须癣毛癣菌的研究提供了重要的数据支持。. 在后续试验中，通过BLASTX序列相似性搜索以及对须癣毛癣菌转录组测序数据的分析确定出须癣毛癣菌锌响应活力因子的基因组成，初步推断出与锌吸收转运相关的其他基因。使用同源重组克隆技术构建了针对ZafA基因的遗传转化用双元载体pDHt/ZafA::hph以及还原用双元载体pDHt/ZafA-bar，利用ATMT法对须癣毛癣菌ZafA基因进行了遗传转化与还原，获得了稳定遗传的ZafA基因转化株和ZafA基因还原株。随后，将上述菌株同标准株一起进行了低锌耐受试验、锌摄取能力测定试验、毛发穿孔试验和皮肤接种试验，综合评价了ZafA蛋白对于须癣毛癣菌锌转运调节能力和毒力的影响。. 本研究首次确定了须癣毛癣菌基因ZafA基因的组成和功能，对明确须癣毛癣菌锌吸收转运调控机制，深入研究须癣毛癣菌致病基因的组成和功能，探讨其感染机制、研究新药物靶点及开发高效疫苗具有重要价值。