甘蓝型油菜抗除草剂突变基因BnAHAS在漂移进程中的重组机制研究

The herbicide resistance from the intrinsic acetohydroxyacid synthase (AHAS) mutant of Brassica napus L. has the great value in breeding. However, the drifting process of the mutant BnAHAS gene with the herbicide-resistance in B. napus could potentially induce agro-ecosystem damages, so that the Agro-ecology safety of the mutant BnAHAS needs to be rigorously evaluated ahead of its release. Our previous results showed that the BnAHAS genes from different sub-genomes had the diverse drifting-frequency to the related species, but the mechanism isn’t clear yet. This study intent to construct five continuous backcross generations by using two relatives (B. rapa and B. juncea) as the gene-receivers and two BnAHAS mutants with same mutation site (Trp-574-Leu) separately from A and C sub-genomes as the gene-providers. Then, confirm the introgression patterns of two BnAHAS genes through allelic genotyping; explore the genotypes diversity of the genome-wide SNP sites in herbicide-resistance plantlets in each generation by the dedicated SNP chip. Thirdly, find out the BnAHAS genes’ recombination mechanism by re-sequencing genomes of the typical individual plants during the generation continuation and analyzing changes of the physical genome sequences. Results of this study will not only disclose the gene-drift mechanism of the mutant homologue BnAHAS genes from different sub-genomes, but also provide the theoretical and experimental basis for the utilization pattern of the herbicide-resistant rapeseed mutant and the bio-safety evaluation on the agro-ecology.

甘蓝型油菜乙酰乳酸合酶（BnAHAS）突变产生的除草剂抗性具有重大育种利用价值。然而，油菜抗除草剂基因漂移的生态安全性备受关注，亟需前瞻性研究。前期研究发现，来源于油菜不同亚基因组的BnAHAS基因在向近缘种漂移进程中具有不同的漂移频率，但其漂移机制还未明晰。本研究拟采用具有相同突变位点但分别位于A、C亚基因组的油菜BnAHAS突变体与白菜和芥菜两个近缘种受体构建多世代抗性分离群体，通过基因分型技术获得不同BnAHAS突变基因的渐渗规律；利用芯片杂交分析各世代抗性单株全基因组SNP位点的基因型谱变化；对代表性的突变基因重组单株进行全基因组重测序，进而从基因组序列上阐明BnAHAS突变基因在漂移世代间的重组机制与特征。研究结果对深入揭示不同亚基因组来源BnAHAS突变基因的漂移机制具有重要的理论意义和实际价值，将为油菜BnAHAS突变体的育种利用模式和生态安全评价提供理论和实验依据。

基于BnAHAS基因突变的甘蓝型油菜非转基因抗除草剂种质的成功创制，为我国油菜田杂草实现一次性化除奠定了技术资源基础，然而白菜、芥菜等近缘种亦是油菜大田的泛生杂草，一旦近缘种杂草通过基因漂移获得除草剂抗性，极可能摧毁未来抗除草剂油菜产业发展。因此，明晰BnAHAS突变基因的生态安全性，对于保障非转基因抗除草剂油菜品种的安全生产均具有重大现实意义。本研究利用具有相同突变位点（Trp574Leu）但位于不同亚基因组的两个突变体M342（BnaA1.AHAS3）和 PN19（BnaC1.AHAS1）为基因源，以白菜或芥菜为漂移受体，杂交得到F1后继续以F1为母本，原白菜亲本Bai1或芥菜亲本Jie2为轮回亲本，持续进行回交指导回交得到BC5代。每一代回交分离群体同时进行除草剂抗性鉴定和抗性位点分子检测。在BC5代后筛选鉴定具有纯和抗性位点的单株收获自交种子，称之为抗性渗透系。对于Bai1或Jie2衍生的一系列回交群体开展了系列研究，结果如下：第一，针对BnAHAS同源基因突变位点开发了特异分子标记，用于检测在白菜或芥菜遗传背景中的抗性位点，效果良好。第二，对每一个回交群体的抗除草剂表型进行调查统计，发现：Bai1或Jie2遗传背景的接受BnAHAS3突变基因的回交分离世代基本符合1:1分离比例，说明符合一对基因控制；Bai1或Jie2遗传背景的接受BnAHAS1突变基因的回交分离世代基本不符合1:1分离比例，且抗性单株比例低于25%。第三，利用50K油菜基因芯片对不同回交世代的代表性单株及原始亲本进行杂交，结果发现，随着回交世代的深入，轮回亲本的遗传背景占比愈高，但渗透系中除抗性基因片段渗入外，还有其它染色体片段形成遗传搭车。第四，对稳定的渗透系进行除草剂剂量效应试验，结果发现，渗透系对苯磺隆、咪唑啉酮等两类除草剂均具有一定的抗性。遗传背景的改变并未改良突变基因对相应除草剂抗性强度的改变。本项目研究结果认为，抗性基因的抗性强度并未因遗传背景改变而降低，但不同亚基因来源的抗性基因其渗透能力差异显著，尽量选用来自于C基因组的抗性基因来培育抗除草剂油菜品种。