玉米高效基因组靶向修饰技术体系的建立及其在抗除草剂玉米创制中的应用

Recent advances in CRISPR/Cas system make it possible to precisely alter DNA sequences in living cells, providing unprecedented control over a plant’s genetic material. However, most of these mutations are created by non-homologous end joining (NHEJ)-mediated gene knockout, homologous recombination (HR)-mediated gene replacement or insertion is still a big challenge in plant. In this project, we will optimize CRISPR/Cas system by testing Cas9 nickases for their ability to stimulate homologous recombination, developing germinivirus as vectors for gene targeting in maize and knockouting ZmKu70 , which can block NHEJ pathway and therefore activate HR pathway. We will test these factors in protoplast, immature embryo, callus and plants from two maize varieties of HiII and zong31. We will further apply these optimized technologies for creating glyphosate-resistant plants through gene replacement of key nucleotides of ZmEPSPS gene. This study will not only establish new genome editing technology for maize gene function analysis and molecular breeding but also provide the insight into the ability to introduce new genetic variation into maize by genome editing breeding technology.

随着基因组编辑技术的日渐成熟，植物基因定点敲除变得简单易行,但是通过同源重组途径实现精确的定点替换和插入等基因靶向修饰技术在植物中仍是急待攻克的难题。本研究拟以CRISPR/Cas系统为重心，通过：1）优化Cas9缺刻酶制造DNA单链缺口；2）利用双生病毒转化体系提高供体模板DNA表达量；3）定点敲除ZmKu70阻断NHEJ途径等多途径入手进行综合调控——以ZmIPK1、ZmUbi1、ZmDst1和ZmEPSPS为研究对象，在玉米HiII和综31两个品种的原生质体、未成熟胚、愈伤和植物中进行系统分析。研究将建立起玉米高效基因组靶向修饰技术体系，推进植物基因组编辑技术的进步，为玉米基因功能解析和分子定向育种提供技术支撑；同时通过基因定点替换ZmEPSPS基因关键核苷酸创制生物安全的抗除草剂玉米优异种质资源，为解决转基因玉米的生物安全问题提供新思路，推进基因组编辑育种技术在玉米生产应用的步伐。

高效、精准的基因定点替换和插入在植物基因功能研究和育种应用上具有重要的意义，是植物基因组编辑研究的热点，而通过同源重组途径实现精确的定点替换和插入等基因靶向修饰技术是急待攻克的难题。本项目研究通过对CRISPR/Cas缺刻酶系统、双生病毒WDV转化系统以及DNA修复途径中Ku70、Ku80等各种关键因子对提高同源重组效率的测试，建立了玉米高效基因组靶向修饰技术体系。同时在技术上，多途径拓展实现基因组靶向修饰：一方面通过对植物体内不同DNA修复途径进行了系统测试，将传统同源重组途径介导的基因组靶向修饰技术扩展到非同源末端连接途径介导的基因组靶向修饰；另一方面结合2016年度单碱基编辑技术的重大突破，将传统同源重组途径才能实现的基因定点替换拓展到单碱基编辑介导的精准基因定点替换技术。此外，研究利用EPSPS、ALS、ACC多个基因成功地创制了具有不同除草剂抗性的玉米、水稻、小麦优异新种质资源。研究中建立的各种基因组编辑修饰技术推进植物基因组编辑技术进步，拓展基因组编辑的应用范围；研究获得的各种精准靶向修饰遗传改良的抗除草剂优异种质资源有助于推进基因组编辑育种技术在玉米等作物中的生产应用步伐。