基于血小板膜伪装的CRISPR-Cas9递送纳米囊的构建及其精准治疗高胆固醇血症的研究

The hypercholesterolemia is likely to cause cardiovascular disease. Encouragingly, the precise gene editing by CRISPR-Cas9 on the Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) gene resulted in the inhibition of PCSK9 expression and reduction of the cholesterol concentration in the blood. However, the current delivery limits the application of CRISPR-Cas9 in the field greatly. Our preliminary study indicated that the synthetic liposomes delivered the CRISPR-Cas9 for the PCSK9 editing effectively in vitro, while poor in vivo. Thus, it is very important to design a new vector to achieve the clinical purpose with this technique. In this program, we will synthesize a novel rigid nanocapsules cloaked with platelet membrane to deliver the CRISPR-Cas9 system in the form of Cas9 protein and sgRNA. We will investigate the degradation of nanocapsules on cellular and animal levels, the improvement of the cellular uptake in the targeting site, and the effect of preventing the phagocytosis by immune cell and reducing the particles caused by complement activation in vivo. We expect that the application of the rigid nanocapsules leads to successful gene editing on PCSK9 in the liver and down-regulation of the blood cholesterol concentration in mice, and clarifies the structure-activity relationship between the new vector and hypercholesterolemia. The implementation of the program will not only develop a new vector for CRISPR-Cas9 delivery, but also make a good chance to find a new way to treat the hypercholesterolemia precisely.

高胆固醇血症容易导致心血管疾病。CRISPR-Cas9精准编辑前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin-9型基因（PCSK9）后，可抑制PCSK9的表达，并降低血液中胆固醇的浓度。我们的前期研究表明，脂质体在体外能有效递送CRISPR-Cas9编辑PCSK9，而体内效果不佳，因此设计新型载体实现它的临床应用十分重要。本课题旨在构建一种新型的血小板膜伪装刚性纳米囊，递送组分为Cas9蛋白和sgRNA的CRISPR-Cas9系统。在细胞与动物水平探讨纳米囊的降解特性，促肝细胞对其的摄入及体内防止免疫反应等功能，并探明其精准编辑PCSK9、下调胆固醇浓度的构效关系，以期实现CRISPR-Cas9系统用于高胆固醇血症的治疗。该项目的实施不仅获得新型CRISPR-Cas9递送载体，可望找到精准治疗高胆固醇血症的新方法。

高胆固醇血症容易导致心血管疾病。CRISPR-Cas9精准编辑前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin-9型基因（PCSK9）后，可抑制PCSK9的表达，并降低血液中胆固醇的浓度。我们开发了血小板膜伪装的刚性纳米囊，可高效地负载目标基因为Pcsk9的治疗性核酸，使其免于核酸酶的降解，且在体内能有效防止免疫细胞的吞噬和减弱补体激活，实现长效循环并增加的肝部蓄积，被肝实质细胞高效摄入，实现Pcsk9基因的高效沉默，LDL-C水平降低~28%。为提高肝部靶向递送效率，并实现规模化制备，我们进一步制备了以磷脂为基础，具有类细胞膜结构的三重靶向的递送系统，可高效负载Cas9/sgRNA，在体外和体内可高效编辑Pcsk9基因，抑制Pcsk9蛋白的表达，从而提高了低密度脂蛋白受体（LDLR）的表达，降低了LDL-C水平。同时，该系统不会引起明显的脱靶效应。此外，我们还开发了其他类型的智能响应型细胞膜仿生纳米递送体系，借助于细胞的同型靶向特性，细胞膜修饰的纳米颗粒可在体内/外特异性识别同型细胞，提高了核酸/小分子化合物在肿瘤细胞/组织中的蓄积，并在酸性环境或近红外光的刺激下，实现药物的控制释放。这些体系，将有可能应用于高胆固醇血症及其他肝部相关疾病的治疗。该项目的实施不仅获得新型CRISPR/Cas9递送载体，有可能为治疗高胆固醇血症提供新策略。本项目资助我们发表署名基金号的论文10篇（1篇影响因子>10，8篇影响因子>5），并申请中国专利7项，广东省药理学会科技成果一等奖（排名6），参加国内学术会议6次。本项目培养毕业硕士生1名、1名在岗博士后、在读博士生2名、在读硕士生6名。