DNA折纸反应器上的单分子酶抑制动力学研究

In this proposal, we aim to establish a model of single-molecule enzymatic inhibition dynamics that reveals different possible passways of inhibitors transfer from catalytic sites to inhibition sites. We will introduce addressable DNA origami as nanoreactors for single molecule enzymatic reactions. A single HRP will be immobilized on a DNA origami reactor and another organic dye will be immobilized in a nearby site as coordinate to position HRP and highly fluorescent product resorufin. By monitoring the fluorescence of resorufin with TIRFM and analyzing its fluctuation, we will investigate the noncompetitive inhibition of resorufin and explore the allosteric effect between catalytic site and inhibition site. This work will help to deep the understanding of interaction mechanism between inhibitors and enzymes, which may provide theoretical guide for inhibitors drugs and inhibition mechanism.

本项目提出以DNA折纸为酶分子反应器，建立单分子酶非竞争抑制动力学模型，揭示抑制剂分子从催化位点进入抑制位点的反应机制。在DNA折纸表面化学偶联一个HRP酶, 利用DNA折纸可精确寻址的特点，在HRP周围固定一个荧光染料为参考坐标，实现HRP和催化反应产物试卤灵分子的空间共定位。利用TIRFM技术，系统研究不同反应物浓度下试卤灵分子的荧光涨落信号随时间变化的轨迹，研究试卤灵产物对HRP催化的非竞争性抑制过程，发现酶催化位点与抑制位点之间的别构效应。该工作有助于深入理解酶抑制剂与酶分子间的相互作用机制，对抑制剂药物的设计及抑制机制，具有理论指导作用。

该项目执行期间, 项目负责人以辣根过氧化酶（HRP）为模型，建立了单分子酶非竞争抑制动力学体系，揭示了抑制剂分子从催化位点进入抑制位点的反应机制。提出以DNA折纸为空间坐标对酶分子精准空间定位的策略,利用该策略实时定位界面上的单个HRP分子并对其催化过程实时监控。通过对荧光产物轨迹的分析揭示催化产物的非竞争抑制，并建立了完整的单分子抑制动力学方程，解释了催化产物对酶促反应动力学影响。项目执行期间发表论文12篇，其中包括4篇影响因子>10的论文(Angew.Chem.Int.Ed.(1)，J.Am.Chem.Soc.(1), Nano Lett.(1), Small(1))，2篇影响因子>9的论文 (Chem. Sci.(2))。培养博士生4名，硕士生2名。完成了项目提出的研究内容与既定目标。.主要取得了如下结果与关键数据：.（1）发展了利用DNA折纸精准定位界面上单个酶分子的方法，除定位功能外，该方法还可以调控酶分子在界面上的扩散速度和扩散方式。.（2）系统研究了单个HRP酶分子的催化动力学过程，发现了HRP的底物非竞争性抑制，建立了抑制动力学方程。.（3）研究了模拟细胞环境中的单个HRP酶分子催化动力学，发现细胞环境中酶的催化及抑制行为与稀溶液完全不同。对真实细胞环境中酶催化过程的理解，未来需全新的研究思路与研究手段。