关键microRNA对结直肠癌Ras蛋白信号通路的调控研究

Ras蛋白在细胞内信号传递和细胞增殖过程中起着关键和核心作用，深入研究Ras蛋白信号通路的调控过程不论对生命过程还是对结直肠癌发病机理的认识都具有非常重要的意义。本研究首先应用miRNA芯片技术和生物信息学分析构建结直肠癌miRNA差异表达谱；然后从RAS信号通路的靶蛋白的生物学功能出发，预测调控Ras蛋白信号通路的关键miRNA；从分子水平上阐明关键miRNA，包括miR-223，miR-31和miR-103/miR-107对RAS信号通路中GTP酶激活蛋白RASA1和NF1的调控机制；进一步在细胞和动物模型中研究关键miRNA对于结肠癌细胞增殖和迁移等功能的影响，期望在阐明miRNA在结直肠癌Ras蛋白信号通路中的重要作用及其调控机制研究方面有所突破。该研究不但有助于Ras蛋白相关的疾病发病机理的研究，对于确定结直肠癌的早期预测指标、发现新的药物治疗靶点都具有重要的意义。

研究发现miRNA可以参与调控肿瘤信号通路并在肿瘤发生和发展中发挥着重要的作用。为了阐明关键miRNA对结直肠癌RAS信号通路的调控机制，我们首先使用生物芯片和qRT-PCR 分析方法检测人结直肠癌组织的miRNA并建立人结直肠癌miRNA差异性表达谱。我们接着在这87个显著异常表达的miRNA中，发现miR-31的变化最为显著，而且生物信息学方法预测miR-31的可能靶点是RAS信号通路的重要调控蛋白RASA1。通过深入研究我们首次阐明miR-31在结直肠癌中激活RAS信号通路而具有原癌基因的功能。具体结果概述如下：首先，我们在人的结肠癌组织和邻近的癌旁组织中发现miR-31与RASA1蛋白存在负相关性。其次，体外实验证明结肠癌细胞过表达miR-31时RASA1蛋白表达水平显著下降，而结肠癌细胞低表达miR-31时RASA1蛋白表达水平会增加。第三，荧光素酶活性检测实验证实miR-31可以直接结合到RASA1转录本的3'-UTR种子位点序列。综上所述，我们实验证明了miR-31可以直接靶向RASA1。进一步的体外结肠癌细胞增殖实验和裸鼠异位结肠瘤实验发现，miR-31在结直肠癌中通过抑制RASA1的翻译，激活RAS信号通路中的RAS蛋白，MEK1/2蛋白和ERK1/2蛋白，提高促增殖因子KI-67和PCNA的表达水平，从而促进结肠癌细胞的生长并导致肿瘤的发生和发展。.因为RASA1是RAS GAPs家族的重要成员，为了更好地揭示关键miRNA对结直肠癌RAS信号通路的调控机制，我们以RASA1为靶点直接进行miRNA预测和筛选，发现miR-24, miR-132, miR-223, miR-182, miR-31, miR-335这6种重要miRNA。我们进一步发现miR-223在结肠组织中含量丰富而且在24例人结肠癌组织中均显著性上调。通过深入研究我们首次揭示miR-223在结直肠癌中被转录因子C/EBP-β激活而具有促进细胞增殖和肿瘤生长的功能，而MEK1/2抑制剂的加入则阻断了miR-223对细胞增殖的影响。此外，我们还发现MiR-223 AMO能显著性抑制裸鼠结肠癌细胞的生长。综上所述，本课题研究不但有助于阐明在结直肠癌中RAS信号通路受miRNA调控的分子机制，而且对于结直肠癌早期预测指标的发现和新靶点治疗药物的筛选都具有重要的指导意义。