基于转录组学的杂色鲍早期发育关键阶段基因调控网络研究

贝类早期发育尤其是附着变态的基因调控网络的阐明对发育生物学、细胞生物学和进化理论有着重要意义，同时在贝类水产养殖上有重要的应用价值。但是贝类早期发育相关基因序列的匮乏和单基因研究手段的低效率限制了这个问题的解答。转录组学方法恰好可以弥补这两点缺陷，为阐明早期发育机理提供了可能。本项目首先通过基于测序的转录组学方法，构建大容量的、覆盖杂色鲍早期发育阶段的基因序列数据库，这解决了基因序列匮乏的障碍；然后通过对关键阶段高深度的基因表达谱的聚类分析，结合全胚原位杂交等实验验证的方法可靠地得到参与各个生物学过程的基因聚类，这就突破了单基因研究手段低效的限制，实现高通量地基因功能解释；在这基础上利用DNaseI印迹和体外转录等实验方法确定关键基因的上游/下游关联基因，建立聚类内部或聚类之间的联系，最终构建杂色鲍早期发育尤其是附着变态阶段的基因调控网络模型。

海洋无脊椎动物的附着变态是重要的海洋生态现象。杂色鲍不仅是我国南方重要的养殖经济贝类，而且是重要的附着变态研究模型。我们以杂色鲍幼体发育为模型，以转录组学方法为主要手段，开展了早期发育关键阶段的基因调控网络研究。我们构建了7个杂色鲍不同发育阶段和1个杂色鲍成体肠道的非均一化转录组文库，在454高通量测序平台上获得366,991条平均长度为300bp的reads。通过拼接得到35,415个unigene，9,513 (26.9%)的unigene获得了功能注释。通过reads与unigene的匹配，获得了每个unigene在每个发育阶段的表达数据。我们从两个方面验证转录组表达数据的可靠性，先是获得了3个在上述7个发育阶段稳定表达的内参基因，它们分别是EIF5A、YB1和OAZ1；再是对另外20个基因进行qPCR并与转录组表达数据相比较，18（90%）个基因的两种表达数据之间的相关性r > 0.6，表明转录组数据具有很高的可信度。我们通过统计学方法挑选出数据可靠的636个基因时序表达模式，并由此构建了基因表达聚类和WGCNA基因网络。结果表明每个发育阶段都具有一批在此阶段特异高表达的基因，我们将这些基因称为特征基因。通过KEGG方法建立了附着变态时期的生物学通路，并由此发现了吞噬小体通路和溶酶体通路在附着变态期间顺次开启，展示了杂色鲍幼体摄食之初获得营养或防御外来细菌的分子机理。通过全胚原位杂交（WMISH）方法，测定了约20个特征基因的空间表达模式。一个EGF相关基因的mRNA在附着后幼体的后肠大量积累，由于此基因结构和时空表达模式的独特性，我们把此基因命名为Hadgut。发现了两个基因家族SARP-19和vdg3各成员时空表达模式上有极高的相关性，我们推测这些基因与消化酶的分泌、消化道的保护和对外源病原的防御相关。通过以上研究我们建立了本领域先进的方法，获得了极高质量的数据，发现了各发育阶段的特征基因，获得了杂色鲍幼体发育期间基因表达调控的全局视野，完全实现了本课题的预定目标。这些成果极大推进了海洋附着变态现象的分子机理研究，并为将来开展防海洋生物污损的应用研究打下坚实基础。