球形红细菌丹参转化液中酚酸类化合物生物合成及转化机制研究

通过光合细菌转化可以提高中药的活性、降低毒性，但其转化机制尚不明确。项目前期利用光合细菌球形红细菌对丹参提取液进行转化，可以提高其降血脂活性、酚酸类成分含量并降低丹参用量。光合细菌酪氨酸代谢产生丹参中酚酸类成分生物合成重要中间体，提示球形红细菌代谢导致其中酚酸类成分增加，有必要从生物合成途径对其转化机制进行研究。本项目拟应用渗透休克原理、质粒消除对球形红细菌中与酚酸类成分生物合成相关酶进行定域，相关基因进行初步定位，同时推断球形红细菌丹参转化液(PDST)中酚酸类成分生物合成途径；依据光合细菌、丹参等物种中酪氨酸解氨酶、4-香豆酸辅酶A连接酶等基因CDS区及保守序列设计各相关基因引物，以球形红细菌基因组DNA及质粒为模板，克隆表达各基因，检测酶活性，验证PDST中酚酸类成分生物合成途径，从分子水平阐明其转化机制。为调控PDST转化过程、球形红细菌及其酶用于其它化合物的生物转化提供理论依据。

通过光合细菌转化可以提高中药的活性、降低毒性，但其转化机制尚不明确。项目利用光合细菌球形红细菌对丹参提取液进行转化，可以提高其降血脂活性、酚酸类成分含量并降低丹参用量。光合细菌酪氨酸代谢产生丹参中酚酸类成分生物合成重要中间体，提示球形红细菌代谢导致其中酚酸类成分增加，有必要从生物合成途径对其转化机制进行研究。本项目应用渗透休克原理分离球形红细菌细胞外液、细胞壁、细胞质、细胞膜，对丹参提取液进行转化，实现对球形红细菌中与酚酸类成分生物合成相关酶进行定域；利用质粒消除球形红细菌对丹参提取液进行转化，实现对相关基因进行初步定位；同时推断球形红细菌丹参转化液(PDST)中酚酸类成分生物合成途径。结果表明，和水提丹参溶液相比较，球形红细菌丹参转化液（20天）指纹图谱17个成分中除1（丹参素）、16、17外，其他成分均增加，球形红细菌各细胞部位转化液指纹图谱17个成分均有一定程度的增加，可见球形红细菌中与酚酸类成分生物合成相关酶处于球形红细菌的各个细胞部位中，以重要中间体迷迭香酸作为标准比较酶活性强弱顺序为：细胞外液＞细胞壁＞细胞质＞细胞膜，如果把等量球形红细菌各细胞部位分离后对丹参提取液进行转化，转化丹参量可提高4倍。分析提示各转化酶位于各细胞部位上，各细胞部位分离后，各酶与转化物的充分接触，转化总体效率得到提高；另外球形红细菌各细胞部位中酶可以模拟丹参中酚酸类化合物生物合成途径，存在相关酶的表达。通过含质粒和不含质粒球形红细菌分别对丹参提取液进行生物转化，转化产物无显著性差别，证明转化基因均位于球形红细菌核DNA上。丹参提取液培养前后球形红细菌菌体蛋白及4种酶的同工酶变化研究表明，培养前后球形红细菌菌体蛋白及4种酶的同工酶谱带差别较大，同工酶的电泳迁移率、活性、所表达同工酶的数目及分布均有差异，培养2-6天蛋白及酶表达量变化最大，14-20天基本稳定。证明丹参能诱导球形红细菌生成新的蛋白质及酶，亦可抑制某些蛋白质和酶的合成,这些蛋白和酶可能参与了丹参化学成分的生物转化。本课题工作为从分子机制上阐明其转化机制、调控PDST转化过程、球形红细菌及其酶用于其它化合物的生物转化提供理论依据。