白花丹参无抗生素标记遗传转化体系的建立及转化MYB基因提高植株和毛状根酚酸类物质的研究

非抗生素选择标记用于药用植物遗传转化是药用植物基因工程亟需解决的问题。本研究以分布在山东的白花丹参为试材，开展非抗生素标记遗传转化的研究。以6-磷酸甘露糖异构酶基因 (PMI) 的正向标记基因或甜菜碱醛脱氢酶基因（BADH）作为筛选标记，以期构建高效、稳定的无抗生素标记的遗传转化系统。同时BADH的高表达有望使白花丹参的抗旱、耐盐碱能力提高。在此基础上进一步构建无抗生素筛选标记的根特异表达启动子TobRB7启动的MYB基因的表达载体，通过农杆菌转化法将白花丹参、玉米和拟南芥的MYB转录因子基因分别转化到白花丹参，获得转基因白花丹参毛状根或植株。采用代谢组学技术分析转基因和对照毛状根或白花丹参根和叶片的酚酸类物质变化，分析MYB基因转化对丹参酚酸类物质合成的影响。以期获得酚酸类物质含量高、指纹图谱与野生型相当的转MYB基因白花丹参植株和毛状根。研究结果可为进一步培育高质量的白花丹参奠定基础。

非抗生素选择标记用于药用植物遗传转化是药用植物基因工程亟需解决的问题。药用植物作为一种特殊用途的植物，无抗生素选择标记的基因工程技术在药用植物上的应用具有重要的应用价值。转化转录因子可有效提高转基因植物中目标代谢物的含量。该项目自实施以来，项目负责人积极组织相关研究人员对该项目进行了白花丹参MYB相关基因的克隆和功能分析，白花丹参无抗生素标记转化体系的建立以及myb基因的转化方面的研究。项目研究过程中分离克隆到白花丹参MYB基因2个: SmPAP1（GenBank ID GU218694）和SmMYBP（GenBank ID KJ009321），酵母双杂交分析表面SmPAP1可以与丹参和拟南芥的bHLH转录因子SmMYC2和AtMYC2互作，将SmPAP1转化白花丹参，测定了转基因丹参根的总酚酸、总黄酮和迷迭香酸、丹酚酸B和丹参素含量，结果表明SmPAP1可以促进总酚酸、总黄酮以及迷迭香酸和丹酚酸B的含量。建立起了PMI无抗生素基因转化体系，获得了无抗生素标记系统的转化丹参SmPAP1（myb转录因子）、拟南芥MYB90的白花丹参，HPLC测定转基因植株的迷迭香酸、丹酚酸B和总酚酸的含量，结果显示过表达SmPAP1的转基因植株根的三种物质的含量分别提高了2.12倍、1.73倍和1.68倍；转化拟南芥MYB90的转基因植株的迷迭香酸、丹酚酸B和总酚酸的含量分别提高了1.76倍、1.41倍和1.54倍。. 该项目还从丹参中分离产丹酚酸样物质的内生真菌以及外源物质对白花丹参毛状根酚酸类合成的影响。还克隆分析了参与丹参酚酸类和丹参酮物质合成相关其他基因，分析发现我们克隆的SmHDR1基因是丹参酮生物合成的关键酶。. 研究结果发表科技论文8篇（都注有国家自然基金资助号(81173489)），其中SCI收录5篇，另发表会议论文4篇。获山东省高等学校优秀科研成果三等奖一项。. 本研究项目克隆到的关键酶和转录因子基因对于丹参的合成生物研究具有重要的意义，利用合成生物学方法对实现丹参的定向遗传育种，能有效降低丹参制剂生产过程的提取成本并缓解对药用丹参资源的压力；为建立起具有生物安全性的白花丹参转基因体系，为白花丹参的遗传改良提供了很有用的技术资料。另一方面也为进一步研发丹参内生真菌生物防治产品提供菌种，预期具有较好的社会和经济效益。