基于微流控芯片的细胞内信号操纵新技术研究

Almost all physiological activities are regulated by calcium signaling in cells. However, the details of regulation by calcium signals are still poorly understood. Since many signal molecules and receptors are involved in multiple signaling pathways, it is difficult to study which temporal-spatial change of calcium regulates the specific pathway. Currently, an attractive method for resolving the roles of signaling network components is directly activation of these components in a spatially constrained and rapid manner, which is independent of upstream signaling and avoids the interference of alternative signal pathways. Calcium clamp is the most common method for controlling calcium oscillation in cells. This method suffers from several disadvantages, such as high reagent consumption, incapability of dealing with individual cells, and difficulty in controlling calcium oscillation. Another methods use optical activation to control calcium and key protein signals in cells. However, these methods only can create highly localized activation of signal transduction in focal point area. In contrast, in more physiological setting, a cell processes a shallow gradient of external environmental cue into a similar gradient of intracellular effectors. Thus, it is necessary to develop new methods to generate more natural, spatially distributed artificial signals in individual cells. In this project, we propose a novel microfluidic approach for generating artificial calcium oscillation and Rho-GTPase signaling in cells. By using interface shifting of laminar flows, the frequency, amplitude and distribution of calcium oscillation and the gradient of activated Rac could be controlled in cells. In combination with optical molecular imaging, we further investigate the role of artificially induced calcium and Rac signals in the regulation of cell polarity as well as the distribution of cAMP/cGMP, PIP3 and Rho-GTPase. This project exhibits important scientific value in revealing the mechanism of signal transduction, and provides a theoretical basis and an innovative technological platform for drug screening.

钙信号是细胞采用的一种普遍的调控方式，由于信号分子受体一般同多条信号通路偶联，难以将特定形式的钙信号与某条信号通路对应起来，而人工建立细胞内信号可以避免旁路信号的干扰，有助于更深入揭示钙信号调控机理。目前常用的细胞内信号操纵方法无法精确控制信号在胞内形成特定的空间分布。在我们建立的基于水力门控的细胞刺激微流控芯片基础上，本项目提出了基于微流控生物芯片的细胞内信号操纵新技术研究：利用高度可控的双负压系统快速切换细胞外液体环境，在细胞内形成特定振幅、频率与浓度梯度分布的钙振荡以及不均一激活的Rac1信号，从而建立可形成更加真实、时空特性更好的胞内信号的微流控芯片平台。并进一步结合功能光学成像技术深入研究钙信号以及Rho-GTPase信号在调控细胞迁移、信号小分子的时空变化、关键蛋白的活性中所起的作用。本课题对于阐明细胞内信号转导机理具有重要科学价值，并促进学科交叉与人才培养。

细胞对其微化学环境的识别与应答的能力，对于生物体的发生、发育等具有至关重要的意义。然而现有的化学刺激技术主要基于微灌注方法，溶液切换时间长、时空分辨率低，溶液操作能力弱，极大限制了其在生物领域的应用。本项目提出了利用微流控芯片建立细胞刺激新技术平台，可高度模拟胞外复杂环境，进而观察细胞动态响应，是研究细胞内信号转导的非常有效的一种方法。我们设计了一种基于水力门控的界面可调微流控芯片，用于研究细胞间钙信号传播。通过控制芯片内鞘流体的时空状态，可精确实现溶液界面的高度时空切换，具有高重现性与高时间分辨（< 50 ms），能够实现通道内不同位置的单个细胞的局部精确刺激。采用该芯片平台，成功实现了ATP对NIH-3T3细胞群体的局部刺激，并发现钙信号可通过间隙连接向毗邻细胞传递。我们还建立一种基于微流控芯片的任意化学波形信号发生器，能够实现优于10赫兹的脉冲化学波和优于0.2 赫兹的连续化学波。结果表明受激细胞既能响应不同幅值的化学信号，也能截频响应其频率的变化。采用快速生成不同浓度的药物对同一细胞的连续脉冲进样刺激，可快速获取单细胞尺度的药物剂量-反应曲线。我们还建立了一种自动动态捕获、刺激、释放单细胞的流式细胞分析的微流控方法。基于该方法，能够快速获取三种不同激动剂刺激单细胞的剂量-反应曲线以及半最大效应浓度。借助其优越的流体操控能力，我们成功实现了不同激动剂对两种细胞的组合顺序刺激，并分析了不同激动剂引发的胞内钙信号的差异。我们进一步建立了可精确预判的微流控化学刺激方法，能选择性对单个靶细胞甚至局部进行高重现性刺激，具有高时空分辨率。此外该方法还具有刺激时间、缓冲时间、刺激液的宽度和位置均高度可控等优点。借助该方法我们成功进行了单细胞以及细胞间的动态钙信号研究。本课题对于揭示细胞内钙信号的分子机理以及调控信号转导类药物筛选具有重要的科学参考价值，并促进生物物理、生物医学及其交叉学科的发展和人才培养。