家蚕蛋白糖酰化途径及其重组人源化糖蛋白的表达研究

糖蛋白是一种结合蛋白质，广泛参与重要的生化与生物学功能，包括蛋白稳定性、免疫功能、酶功能、细胞黏附等，重组糖蛋白的合成是生物医学基础研究和临床应用的关键课题。该项目针对昆虫表达重组糖蛋白不具有复杂N-糖酰的缺陷，将哺乳动物细胞的糖基转移酶Gn-TII,Gal TI,2,6-Sial-T（ST6 GalII）和2,3-Sial-T（ST3GalIII）以及两种转化N-乙酰甘露糖胺成CMP-吐液酸的酶，即SAS和CMP-SAS通过转基因方法到家蚕染色体组构建转基因细胞系及幼虫，使其能产生类似于哺乳动物的复杂糖苷，从而产生功能和活性类似于哺乳动物的糖蛋白，完善昆虫蛋白糖酰化途径，表达人源化糖蛋白，为糖蛋白的结构和功能等研究奠定基础，同时为糖蛋白合成开辟新路径。

糖蛋白是一种结合蛋白质，广泛参与重要的生化与生物学功能，包括蛋白稳定性、免疫功能、酶功能、细胞黏附等，重组糖蛋白的合成是生物医学基础研究和临床应用的关键课题。. 本研究针对昆虫表达重组糖蛋白不具有复杂N-糖酰的缺陷，通过克隆得到哺乳动物细胞中糖基化所必须的基因N-乙酰葡萄糖胺转移酶II，beta-1,4-半乳糖基转移酶I，alpha-2,6-及alpha-2,3- 唾液酸转移酶，并利用piggyBac转座子将它们及GFP基因和Neor基因共同转座至家蚕BmN细胞系的基因组中，通过G418筛选得到了一株抗G418的、发绿色荧光的转基因家蚕细胞系。基因组PCR、RT-PCR及Splinkerette-PCR鉴定表明所得的转基因细胞系中含有并且能表达上述四个基因。通过酶活检测以及糖基化蛋白表达和糖型鉴定的方法来验证了转基因细胞的功能。测定转基因细胞中beta-1,4-半乳糖转移酶（GalT）活性表明，转基因细胞具有GalT活性；转基因细胞可以与正常细胞一样表达外源糖基化蛋白-人丁酰胆碱酯酶（hBchE）；转基因细胞和正常BmN细胞表达人丁酰胆碱酯酶后的细胞总糖糖型存在差异，正常BmN细胞有糖型结构8种，转基因细胞在此基础上多了5种糖型，其中3种是杂合型或复杂型，2种是高甘露糖型，说明转基因细胞中的杂合型和复杂型N-糖链更接近于哺乳动物水平。另外，我们利用RNAi（RNA interference）技术来阻断GlcNAcase的功能。通过将合成的dsGlcNAcase直接加入正常BmN细胞培养物中，再利用real-time PCR 来检测GlcNAcase的表达。结果表明80 nM 的dsGlcNAcase即可干扰约82%的GlcNAcase的合成。. 该研究构建的转基因家蚕细胞系，能产生类似于哺乳动物的复杂糖苷，从而产生功能和活性类似于哺乳动物的糖蛋白，完善昆虫蛋白糖酰化途径，表达人源化糖蛋白，为糖蛋白的结构和功能等研究奠定基础，同时为糖蛋白合成开辟新路径。