产甘油假丝酵母甘油合成关键酶催化机理及其受高渗透压诱导分子机制研究

产甘油假丝酵母WL2002-5是一株能在高渗条件下迅速生长、高效合成甘油、具有自主知识产权的工业生产菌株。为目前世界合成甘油效率最高的菌株之一。3-磷酸甘油脱氢酶（GPDH）是微生物细胞中由前体磷酸二羟丙酮合成甘油的关键酶，在酵母细胞的高渗透压适应和调节中起着重要作用。前期研究表明，高渗透压因子（如浓度为25%的葡萄糖和5%的NaCl溶液等）可显著诱导CgGPDH酶活力增加，大幅提高甘油积累量。为更好地理解CgGPDH受高渗透压诱导的分子机理，本研究在已成功克隆该新酶编码基因（FEMS Yeast Research ，2008, 30(4):508-14）并初步获得蛋白单晶的基础上，进一步测定并解析CgGPDH单体蛋白及该酶与底物、辅酶NADH和高渗透压因子等相互作用的蛋白质复合物三维结构，为阐明高渗条件下产甘油假丝酵母GPDH高效合成甘油的催化机理提供理论依据。相关研究未见报道。

3-磷酸甘油脱氢酶（GPDH）是微生物酵母细胞中由前体磷酸二羟丙酮合成甘油的关键酶，在酵母细胞的高渗透压适应和调节中起着重要作用。前期研究表明，高渗透压因子（如浓度为25%的葡萄糖和5%的NaCl溶液等）可显著诱导GPDH酶活力增加，大幅提高酵母甘油积累量。为更好地理解GPDH受高渗透压诱导的分子机理，本研究在已成功克隆该酶编码基因的基础上，将3-磷酸甘油脱氢酶编码基因GPDH在大肠杆菌进行了高效表达和纯化，纯化后比酶活达到152.6mU/mg。并对酶学性质进行了初步研究，结果表明以DHAP为底物GPDH的Km值为0.55mmol/L，Vmax为1.06umol/(mL/min)。利用亲和层析、离子交换和分子筛纯化条件的摸索，确定了GPDH蛋白质的纯化方案，得到纯度达到95%以上的蛋白；利用晶体生长试剂盒对蛋白质GPDH结晶条件进行了筛选；获得了能够进行X-射线衍射研究的晶体；进一步测定并尝试解析了GPDH三维结构，结果表明GPDH结构主要由N-端NAD结合结构域和C-端底物DHAP结合结构域组成，酶活性口袋位于这两个结构域之间的沟槽中。N-端结构域主要由平行β折叠片和反向平行β折叠片组成的疏水内核，折叠片之间由α-螺旋连接，辅酶NAD结合在β折叠片内核的边缘。C-端结构域主要α-螺旋组成。上述结果为理解酵母GPDH合成甘油的催化机理提供了一定的理论依据。. 研究过程中发表研究论文22 篇， SCI 论文9 篇，其中IF>3的SCI论文2篇；参编科学出版社的《2012年中国工业生物技术发展战略报告》1个章节的编写；申请国家发明专利8项，授权国家发明专利3项；合作培养博士研究生4名，硕士研究生8名；研究组成员发表国际学术会议论文5篇，报告5人次，发表国内学术会议论文30篇。