Sur1-Trpm4阻滞剂格列本脲联合低温对成人缺血缺氧性脑病的防治及机制研究

Hypothermia is one of the few effective clinical treatment in hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE) and has been the first recommendation for the treatment of HIE. However, the short therapy time window, incomplete therapeutic effects and rebounded cerebral edema during rewarming stage have greatly limited its clinical application. Recently, Glibenclamide, the specific inhibitor of sulfonylurea receptor 1 - transient receptor potential M4 (Sur1-Trpm4) channel has been attracted a lot attentions because its protection role in treatment of ischemic brain injury. Glibenclamide has also been proven to have a good effect on protection of neurons and the integrity of the endothelial cells. Our preliminary studies showed that Glibenclamide enhanced the neuroprotective effect of hypothermia in oxygen-glucose deprivation nerve cells model and transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) rats. In this study, Sur1 and trpm4 proteins will be silenced or knockdown by siRNA or CRISPR/Cas9 technology in vitro or in vivo HIE models. Then we will further investigate whether Glibenclamide will enhance the efficacy of hypothermia, extend hypothermia therapeutic time window and reduce rebound cerebral edema during rewarming in HIE model.

已经证明低温是临床有效的脑保护措施，在缺血缺氧性脑病（HIE）的治疗中作为I级推荐。但低温的短时间窗、有限的疗效及复温后脑水肿反弹限制了其治疗效果。近年来发现Sur1-Trpm4通道阻滞剂格列本脲对缺血性脑损伤具有显著的保护作用，但在成人HIE中的作用尚未见研究。我们前期利用体外糖氧剥夺神经细胞及大脑局灶性缺血大鼠研究发现格列本脲对神经元和内皮细胞均具有保护作用，且可显著增强低温的治疗作用。本课题拟在成熟的HIE体内、体外模型上，采用siRNA 及CRISPR/Cas9等技术进一步研究格列本脲是否能通过干预Sur1-Trpm4通道而达到提高低温治疗HIE的治疗效果、延长低温治疗的时间窗及预防或减轻复温后脑水肿反弹，并通过Sur1-Trpm4上下游基因调控和表达的研究等明确低温和格列本脲的协同脑保护机制，旨在为临床在低温治疗成人HIE时联合使用Sur1-Trpm4阻滞剂获得实验依据。

已经证明低温是临床有效的脑保护措施，在缺氧缺血性脑病（HIE）的治疗中作为I级推荐。但低温的短时间窗、有限的疗效及复温后脑水肿反弹限制了其治疗效果。近年来发现Sur1-Trpm4通道阻滞剂格列本脲对缺血性脑损伤具有显著的保护作用，但在成人HIE中的作用尚未见研究。本课题研究格列本脲是否能通过干预Sur1-Trpm4通道而改善HIE脑损伤、提高低温治疗效果、延长低温治疗时间窗及预防或减轻复温后脑水肿反弹。结果发现：（1）在模拟HIE的大鼠心脏骤停/心肺复苏（CA/CPR）模型上，格列本脲可以显著改善动物的生存率、神经功能以及病理学损伤，其作用可能与格列本脲抑制了Sur1-Trpm4通道的活性有关。（2）格列本脲与亚低温在改善CA/CPR造模大鼠生存率、神经功能和病理学损伤上作用相当，且两者联合时对组织损伤的保护作用更佳，其机制可能与格列本脲抑制Sur1-Trpm4通道的开放、而亚低温抑制Sur1-Trpm4通道的构成亚基Sur1和Trpm4的表达有关。（3）格列本脲显著改善CA/CPR造模大鼠DWI上高信号的出现，提示格列本脲可防止CA/CPR后脑水肿的发生。（4）在大鼠的短暂性大脑中动脉线栓栓塞（tMCAO）模型上，亚低温干预后快速复温（3℃/h）可建立了复温反跳性脑水肿模型，其机制可能与快速复温后血脑屏障破坏加重及炎性因子表达增加有关，而米诺环素可防止复温反跳的发生。（5）在模拟恶性脑梗死的大鼠5h- tMCAO模型上，格列本脲和亚低温对造模大鼠具有协同神经保护作用，表现为显著降低水肿体积、改善神经行为功能及防止紧密连接丢失。（6）亚低温单独在tMCAO造模后6小时启动已无神经保护作用，但同时给予格列本脲可将亚低温的作用时间窗延长至8小时。（7）格列本脲可改善癫痫持续状态造模动物的生存率、降低其再发癫痫的频率及持续时间，并减轻癫痫持续状态引起的脑水肿、神经元损伤和胶质细胞活化；利用siRNA敲低Trpm4后动物的神经损伤亦明显减轻。综上，这些结果提示，格列本脲可能通过抑制Sur1-Trpm4通道开放而改善HIE脑损伤、提高低温治疗效果、延长低温治疗时间窗、减轻恶性脑梗死或癫痫持续状态后脑水肿的发生。本项目为促进格列本脲的临床转化及亚低温在脑梗死的临床应用提供了实验依据。