中药注射剂双黄连I型过敏反应预警体系的建立及过敏原筛查与确认

Anaphylactic shock, which may threaten human life, is the most serious side effect causing by Chinese herbal injections (CHI)-ShuangHuangLian (SHL).The "dredging" and "blockage" methods are effective but difficult to carry out. This study aims to provide a scientific technical support for effectively implementing the methods of "dredging" (technology improvement of allergen screening and validating) and"blockage"(precaution system can prevent the spread of so-called qualified products with high sensitization risk). In order to sensitively reflect the probability of occurrence of type I hypersensitivity reactions, we integrate the latest immunology researches into this study. Furthermore, combining biological quality control with immunological parameters is an effective method to avoid the anaphylaxis causing by fluctuations in the SHL quality and achieve a linkage precaution of "quality" and "toxicity". Starting from the molecular weight distribution characteristic of SHL, we choose allergen screening methods used for macromolecule and micromolecule in line with immunology principles. Many validating methods with considerable difficulties and skillful technologiesare first used in CHI researches, such as humanization RBL-2H3 cell degranulation model, patient basophil activation tests and directed remove antigen constituents by immuno-affinity column to confirm the antigenicity. In this study, we will provide a feasible solution to prevent type I hypersensitivity reactions causing by CHI-SHL.

中药注射剂双黄连进入临床引发的不良反应中过敏性休克最为突出与严重，可危及人的生命。"疏"、"堵"并举最为有效却难以实施。项目的目的就是要为"疏"(过敏原筛证带来的工艺改进)、"堵"(预警体系可防范高致敏风险的"合格"产品流入市场)的有效实施提供科学的技术支撑。课题在预警体系中将国外免疫学最新研究成果纳入，是为能灵敏反映I型超敏反应发生概率，而将生物质控与免疫学参数结合，则可有效的防范因双黄连质量波动所带来的过敏反应，实现"质"与"毒"联动预警。筛查致敏原从双黄连分子量分布特点出发，对大分子及小分子物质分别采用符合免疫学原理的致敏原筛查方案，验证体系中无论是人化RBL细胞脱颗粒模型、人全血中嗜碱粒细胞活化测定，还是免疫亲和柱定向剔除抗原成分来确认其抗原性，均为中药注射剂研究之首创，有很高的技术含量与相当的难度。通过本项目可为中药注射剂(双黄连)I型超敏反应的防控提供切实而可行的解决方案。

按计划任务，初步建立了双黄连注射剂I型超敏反应预警体系，主要包括两大块内容：一是找出能代表双黄连多成分特征的适合建立质控的生物活性，以提升其对药品质量的控制；二是找到适合用于双黄连I型超敏反应预警免疫学参数。在生物质控方面，通过对双黄连近十种生物活性筛查，最后磷选出两种能有效代表双黄连多成分的生物活性的指标，即双黄连在0.03～0.24%浓度范围对DPPH的清除，以及在0.130～1%浓度范围内对LPS刺激264.7细胞分泌NO，都有良好线性关系。经方法学考察，包括精密度、重复性与稳定性等在内的各项指标，完全符合用于制控双黄连的质量；在免疫学研究方面面，首先比较了阳性致敏物经典的卵清蛋白（OVA）与自制虾蛋白免疫学特征，最后选择了在小鼠体内免疫原性更佳的虾蛋白作为实验的阳性致敏蛋白，并考察了致敏最佳条件。以此作为双黄连致敏动物的操作规程(SOP)。以致敏动物血清致敏嗜碱粒细胞株RBL2H3细胞或原代腹腔肥大细胞，再以虾蛋白或双黄连攻击，也能见于到细胞脱颗粒现象，且多种代表细胞脱颗粒的指标，如显微镜直观照片、β-己糖胺酶、组织胺、胞内ROS、Annexin V及胞内钙等均具有相当好的一致性。但简便、灵敏与经济及对设备依赖度等因素考虑，我们推荐以β-己糖胺酶为检测指标，不必每项指标均进行测定。从主要成分致敏性看，绿原酸引起致敏的可能性的确要大于黄芩苷与连翘苷。从不同批次三精双黄连注射液（被动皮肤过敏实验PCA显示均为合格产品）多指标致敏性评估研究结果看，多批次双黄连血清总IgE水平及IL-4增高，且与正常对照组差异显著，说明有差异者较其它批次更有致敏的倾向性，同时也说明血清总IgE、IL-4测定对过敏性风险判断与评估有积极意义。因此，建议生产厂家在以后出厂产品中增加总IgE、IL-4及生物质控来减少因质量而造成的过敏风险。总之，单纯以PCA判断双黄连的致敏风险是不够的，通过本项目研究，我们认为应当把能代表多成分生物活性的质控指标与更为灵敏的预防过敏指标形成出厂前的“防火墙”，再通过临床实际不断修正闸门的高度，最终达到预警也防控的目的。