一种新型植物毒蛋白--蒜头果蛋白的基因克隆与结构初步分析

In the previous research, Melanin, a new toxin,was isolated from seeds of Malania oleifera by our research group. And it was found that Melanin is a type II Ribosome-inactivating proteins (RIPS), composed of chain A and B that are connected by a pair of disulfide bonds. 10 amino acid has been determined at the N-Terminal of the two chains. Activity test showed that its IC50 on HeLa cells is 1.26nmol/L and has a significant role of inducing apoptosis in cancer cells. But, we still know the potential pharmaceutical protein too little, even nothing about its amino acid sequence and structure. Therefore, this project plan to filter the gene fragment of Malanin through the construction of cDNA library and PCR techniques.And also we will use 3'-RACE and SMART-RACE to obtain full length cDNA gene of Malanin. Then to speculate the amino acid sequence. Finally, the molecular simulation on MS software is used to predict the advanced structures and properties. We hope that this study can become the foundation for the research on the link between structure and activity of Malanin in the future.

课题组在前期研究中，从蒜头果种子中分离得到一种新的植物毒素--蒜头果蛋白（Melanin），明确了Melanin是II型核糖体失活蛋白（RIPS），由A、B两条链通过一对二硫键相连，并确定两条链N末端10个氨基酸序列。活性研究发现Melanin对HeLa细胞的IC50为1.26nmol/L，并有显著的诱导癌细胞凋亡的作用。但对于这一潜在的药用蛋白，还知之甚少，对它的一级结构也几乎一无所知。因此，本项目拟通过构建cDNA文库及PCR技术，筛选目的基因片段，利用3'-RACE和SMART-RACE获取malanin全长cDNA基因，推测氨基酸序列。在materials studio（MS）软件的Forcite等模块下来实现分子模拟，分析其合理的高级结构及性质。获知malanin翻译后加工剪切的情况。为今后构效的研究奠定基础。

本课题组在前期研究中，从中国特有的单种属植物蒜头果的种子分离得到一种新的植物毒素——蒜头果蛋白（Malanin），明确了蒜头果蛋白是由A、B两条链通过一对二硫键相连，并确定两条链N末端10个氨基酸序列。活性研究发现蒜头果蛋白对多种癌细胞有显著的细胞毒性和诱导癌细胞凋亡的作用。但，不管是其分子结构、构效关系，还是理化性质，我们对蒜头果蛋白都知之甚少。本项目通过提取蒜头果果实总RNA，构建cDNA文库，进行了蒜头果蛋白malanin 目的cDNA 基因的克隆与测序工作，并对蒜头果蛋白进行酶切实验，MS和MS/MS质谱检测分析，在NCBI、NCBI-Viridiplantae、NCBI Santalales和Uniprot中搜索比对氨基酸序列，但没有找到相似度较理想的蛋白质。而后对蒜头果蛋白的分子结构特征进行了系统研究，如分子量、等电点、含糖量、糖链类型、氨基酸组成等，体外翻译抑制证明了分子量较大的A链具有抑制蛋白质合成的能力，分子量较小的B链具有凝集素活性，明确蒜头果蛋白与蓖麻毒蛋白一样能抑制体外翻译系统蛋白质的合成，构成异二聚体蒜头果蛋白的两条链承担了不同的生物学功能，符合II型核糖体失活蛋白的分子特点，从而初步揭示了蒜头果蛋白具有强烈细胞毒性的分子机制，更进一步证明蒜头果蛋白是II型核糖体失活蛋白。并对蒜头果蛋白进行了化学修饰，确定了几种和蒜头果蛋白生物学活性密切相关的氨基酸残基，对蒜头果蛋白的结构功能关系做了初步探索。采用实时荧光半定量PCR法检测蒜头果蛋白对癌细胞端粒酶活性的影响，可初步认为蒜头果蛋白具有抑制hTERT mRNA表达的作用。鉴于蒜头果蛋白的应用前景，本项目的研究将为进一步深入研究这个高活性的植物毒蛋白提供很好的借鉴。