蒜头果种子生物合成神经酸关键功能基因的鉴别与功能分析

Nervonic acid (C24:1, cis-tetracos-15-enoic acid) is an unusual very-long-chain mono-unsaturated fatty acid. Owing to nervonic acid is an indispensable substrate for the development of brain and neuro, it is commercially a critical feedstock for producing medicinal and nutraceutical productions. Due to its scarcity from animal resources, it draws great attention to developing nervonic acid productions from plant oil resources for increasing the commercial supply in recent years. Malania oleifera, an oilseed plant endemic to south-western China, gives a great channel to discover and develop nervonic acid resources because its seed contains rich nervonic acids (nervonic acid content >40%). In this proposal, we are planning to dissect the molecular mechanism of nervonic acids biosynthesis in developing seeds of M. oleifera, focusing on 1) investigating the pattern of oil accumulation and the biosynthesis trend of nervonic acids with seed development; 2) identifying the critical genes or regulators responsible for nervonic acids biosynthesis using high-throughput transcriptome sequencing method; 3) conducting the cloning and functional analyses for targeted genes by transferring and heterologously over-expressing the target genes in the yeast system and rapeseed plants. Definitely, this study will not only provide novel data, theoretically, to understand the molecule mechanism underlain M. oleifera seeds accumulate rich nervonic acids, but also serve to genetic improvement and genic engineering for producing nervonic acid resources by using biotechnological methods in practice.

神经酸（C24:1，顺-15-二十四碳单烯酸）是一种超长链单不饱和脂肪酸，神经酸是脑神经发育的重要成分，具有重要的药用和保健功效。由于动物源的神经酸资源极其缺乏，近年来发展植物源神经酸资源、增加神经酸的供给已经引起国内外高度关注。蒜头果（Malania oleifera）是我国特有的资源植物，其种子富含神经酸（含量>40%），为植物源神经酸的发掘与利用提供了崭新的途径。本研究围绕蒜头果种子高效累积神经酸的分子机理，通过调查神经酸在蒜头果种子发育过程中的累积规律，结合高通量转录组测序分析，鉴别蒜头果生物合成神经酸的关键功能基因或调控因子，进一步克隆并分别在酵母和油菜中异源表达、分析，解析若干关键功能基因或调控因子在神经酸生物合成过程中的作用机理。该研究不仅为理解植物种子高效累积神经酸的分子机理提供理论依据，而且为旨在提高油料作物种子神经酸含量的遗传改良和基因工程实践提供技术支撑和基因源。

蒜头果是我国西南地区特有的常绿阔叶木本油料作物，它的种子富含有对人体健康至关重要的神经酸（C24:1,高达40%-60%）。蒜头果种子油是一种很有前途的神经酸来源，但是目前对其神经酸生物合成的生理和分子机理知之甚少。.为明确蒜头果种子油脂累积规律，本研究调查了蒜头果4个不同发育时期种子的油脂成分。结果显示随着种子发育，神经酸含量逐步提高。以油脂累积初期和油脂快速累积时期的种子为材料，采用高通量转录组测序，获得了55843个功能注释的基因，具有差异表达的基因22833个，其中有198个油脂合成相关基因，包括脂肪酸从头合成、脂肪酸碳链延伸和TAG组装过程的功能基因。采用qPCR分析了超长链脂肪酸延伸过程中关键基因（KCS, KCR, HCD和 ECR）的表达模式。大量遗传信息的获得以及基因的差异表达分析，为后期基因功能分析，解析蒜头果超长链脂肪酸累积的分子机制奠定了坚实的基础。.KCS是催化超长链脂肪酸延伸的关键限速酶，而且具有明显的底物识别特异性，因此我们重点分析了β-酮脂酰CoA 合成酶（KCS, 3-ketoacyl-CoA synthase）的催化功能。运用生物信息学方法在蒜头果全基因组中鉴定到18个KCS（3-ketoacyl-CoA sythetase）基因。系统发育分析发现有两个基因属于FAE-like分支，6个属于KCS-like分支，8个属于FDH-like 分支和2个CER分支。我们用RT-PCR克隆了FAE-like分支的两个基因Maole003085.T1和Maole004215.T1的全长编码框，分别编码516和518个氨基酸，包含KCS家族保守的活性位点。利用酵母异源表达分析了其催化功能，研究发现Maole003085.T1能产生C22:1, Maole004215.T1能合成C22/C22:1和C24/C24:1四种超长链脂肪酸。结果说明Maole003085.T1和Maole004215.T1具有不同的底物偏爱性，且Maole004215.T1具有合成神经酸的功能。进一步研究发现Maole003085.T1和Maole004215.T1能以不同的长链脂肪酸为底物，产生不同的超长链脂肪酸，说明不同底物之间有竞争性。此外，我们发现KCS-like亚家族的两个KCS基因功能，转化拟南芥能产生神经酸。利用酵母和植物表达系统，共发掘3个具有神经酸催