象耳豆根结线虫在海南岛的生存适应性及其分子机制研究

Meloidogyne enterolobii,alternate name M.mayaguensis ,is now widely distributed in tropical and subtropical regions around the world. It is recognized as a potentially harmful pathogenic root knot nematode for cultivated crops due to its peculiarity of pathogenicity, molecular characteristics and interaction with plants. In recent years,this species has the fast expansion trend in Hainan island ,and would bring a great threaten to the crop safety of our country. This study analyze and estimate the host adapting ability, reproductive capacity, adversity (temperature, humidity and pH ) ability and nematicide resistance level of M.enterolobii, so that the existence adaptability of this nematode would be explained. the Hsp70 genes function would be certified by cloning Hsp70 genes, constructing the different source of expression vectors and identifying RNAi phenotype, in order to probe the mechanism of heat resistance and nematicide resisitance of M. enterolobii from the molecular level.

象耳豆根结线虫又名玛雅根结线虫，目前广泛分布于世界热带亚热带地区，由于由于其致病性和分子特征以及与植物互作关系的独特性，被认为是一种对农作物具有潜在危害性的重要病原根结线虫。近年来该种在海南岛显示快速蔓延趋势,其发生与为害将给我国的作物安全带来巨大威胁。本研究对象耳豆根结线虫的寄主适应能力、繁殖能力、逆境（温度、湿度、pH值）适应能力和抗药性水平进行分析和评价，阐释其生存适应性；并通过象耳豆根结线虫的Hsp70基因克隆、高效异源表达载体构建和RNAi表型鉴定，验证象耳豆根结线虫的Hsp70基因功能，从分子水平上探讨象耳豆根结线虫的耐热和抗药机制。

M.enterolobii 是我国乃至世界热带和亚热带地区最具威胁的根结线虫种类，研究其生存适应机制，对于阐明其侵染过程中生物因子间和生物因子与非生物因子间的相互作用，研制开发持续有效控制技术具有重要意义。本研究通过研究M.enterolobii的寄主适应能力、繁殖能力、对环境（温度、湿度、pH值）和药剂等因子的表型表现，并通过M.enterolobii Hsp70基因全长克隆、高效异源表达载体构建、构建的工程菌的耐热和抗药性分析、RNAi表型鉴定等技术手段研究其Hsp70基因的功能，初步从分子水平解析其生存适应机制，从而为该线虫防控技术研究提供科学依据。.本项目选取了23份葫芦科蔬菜种质资源、220多种红麻种质资源及常见蔬菜种质资源进行了寄主适应能力的测定，明确了28份常见蔬菜品种对M.enterolobii的抗性水平，筛选到葫芦科蔬菜抗性品种4份，红麻免疫或抗性品种30余份，高感品种8份。通过室内离体测定的方法，确定温度、湿度和pH 与M.enterolobii 存活率的关系，同样通过离体测定的方式测定了M.enterolobii抗性群体二龄幼虫对常见杀线虫药剂噻唑膦的抗性水平是敏感种群的1.43倍，明确了其对阿维菌素、丁硫克百威等常见杀线虫剂的敏感水平。.以M.enterolobii为材料，克隆得到其Actin基因和Hsp70基因全长cDNA序列。对其进行了同源性分析和生物信息学分析；构建了pEASY-E1-MeHsp70和pET30a-MeHsp70原核表达载体。热稳定性测定表明，转入pET30a-MeHsp70基因的大肠杆菌BL21热稳定性相对较好；而转入pEASY-E1-MeHsp70、转入空载pET30a、转入空载pEASY-E1的大肠杆菌BL21和大肠杆菌BL21原始菌株热稳定性相对较差。SDS-PAGE凝胶电泳和RT-PCR分析表明，转pET30a-MeHsp70的大肠杆菌Hsp70基因上调表达。重组菌株和大肠杆菌BL21原始菌种生长曲线测定表明转入pET30a-MeHsp70载体的菌株调整期滞留时间长于其它菌株。RNAi试验结果表明，M.enterolobiiJ2经MeHsp70dsRNA浸泡处理后导致番茄根结形成数量比对照明显减少，证明MeHsp70在M.enterolobii的侵染中起作用。