TGFβ信号通路对基质蛋白表达的调控作用研究

Molluscan matrix proteins are considered to play important roles in pearl and shell formation. Investigating the effect of the TGFβ signaling pathway on matrix proteins expression would help us to elucidate the mechanism and signaling pathway involved in pearl formation on cellular and molecular level. Here, we intend to clone the homologous genes of several important TGFβ signaling pathway proteins, including receptor Smad5, co-receptor Smad4, inhibitroy Smad6 as well as cartilage formation related protein Sox9 and Sox5, from the pearl oyster, Pinctada fucata，which may contribute to investigate the effect of the TGFβ signaling pathway on regulating the expression levels of those pearl and shell formation related matrix proteins. To identify the matrix proteins probably regulated by TGFβ signals, we intend to analyze the mRNA expression levels of the potential transcription factors and matrix proteins after the receptor smad proteins (Smad3 or Smad5) enhancement as well as inhibition. In this study, we investigate the binding affinity of Sox9 and the promoter of KRMP by both chromatin immunoprecipitation assay (CHIP) and Electrophoretic mobility shift assays (EMSAs). Meanwhile, we intend to study the effect of transcription factors such as Smad3, Smad5 and Sox9 on regulating the transcription activity of the promoter of KRMP by luciferase reporter assays. These results would help to elucidate the particular mechanism and TGFβ signaling pathway on regulating the expression level of matrix protein KRMP.

基质蛋白在珍珠和贝壳的形成过程中具有重要的作用，研究TGFβ信号通路对其表达的调控作用，将有助于从细胞和分子水平揭示珍珠形成的机理及信号转导途径。本课题拟从合浦珠母贝体内克隆TGFβ信号通路中几种关键蛋白的同源编码基因，包括受体蛋白Smad5、辅助因子Smad4、拮抗因子Smad6以及软骨形成相关蛋白Sox9、Sox5，进而研究TGFβ信号对珍珠和贝基质蛋白表达的调控作用。刺激或抑制Smad3和Smad5，检测不同生长状态下各转录因子和基质蛋白mRNA表达的变化情况，从而鉴定可能受到TGFβ信号调控的基质蛋白。重点以基质蛋白KRMP为对象，利用CHIP和EMSA等实验研究Sox9蛋白与其启动子的结合位点；利用荧光素酶报告基因载体（pGL3）研究Smad3、Smad5及Sox9对KRMP启动子转录活性的调节作用，以期探明TGFβ信号通路调控KRMP蛋白表达的机制和信号传导途径。

在合浦珠母贝贝壳和珍珠形成过程中，基质蛋白发挥了十分重要的作用，本项目旨在研究生物矿化过程中基质蛋白的表达调控机制，尤其是TGFβ信号通路对富含赖氨酸的基质蛋白（KRMP）表达的调控作用，以揭示珍珠形成过程中的分子机理及信号转导途径。本项目的研究成果将为特殊仿生材料的研制提供理论依据。取得的主要成果如下：. 1）克隆得到了TGFβ信号通路中4种转录因子Pf-Smad3/4/5/6，以及转录因子Pf-Sox9的cDNA序列及其编码的氨基酸序列，并通过结构分析进行了确认。组织表达分析研究表明，TGFβ信号通路成员在鳃和外套膜中表达量较高，并定位于外套膜中褶、外褶、缘膜区上皮细胞等矿化相关部位，推测其与生物矿化过程的相关性。幼贝发育不同时期基因表达的分析结果表明，Smad蛋白在幼贝发育和贝壳形成的不同时期皆发挥了重要作用。. 2）克隆鉴定了TGFβ/BMP信号通路的受体基因，PfBMPR1B和PfBAMBI，并应用酵母双杂交技术证实了信号通路各成员之间存在互作关系。初步阐述了生物矿化过程中TGFβ信号通路的级联反应模式。. 3） 研究了TGFβ信号通路对几种基质蛋白基因表达的影响，应用Real-Time PCR，western检测得知，用BMP2激活TGFβ信号通路时，可提高KRMP的表达，推测其通过增强Smad1/5的蛋白磷酸化水平而实现的。BMP2的竞争性抑制剂Noggin可抑制KRMP家族蛋白基因的表达。当受体BMPR1B的基因被抑制后，KRMP蛋白的表达水平也降低。通过RNAi实验抑制Pf-Smad3/5/6基因，发现不同的基质蛋白表达呈现不同的变化规律，贝壳的表型也有变化，表明TGFβ信号通路对基质蛋白的调控网络是十分复杂的。. 4） 克隆得到了KRMP3/4/8的核心启动子序列，证实了转录因子Sox9对KRMP启动子具有转录抑制作用，并初步确定了Sox9与KRMP3启动子的结合区域。证实了TGFβ信号通路参与了对基质蛋白基因的转录调控过程。. 5） TGFβ信号通路在贝壳损伤修复过程中的作用研究表明，当抑制Smad3/6基因的表达，不同基质蛋白呈现不同的变化规律，说明在贝壳修复过程中TGFβ信号通路与其他调控机制共同作用于新贝壳的形成。