转录因子Kruppel-样因子2在雷帕霉素导致内皮功能失调中的介导作用

雷帕霉素药物洗脱支架（SES）置入血管导致内皮功能失调的分子机制不清楚。雷帕霉素可降低内皮中抗栓基因表达，升高促栓基因表达，诱发内皮功能失调。而在内皮细胞特异表达的转录因子Kruppel-样因子2（KLF2）可通过升高抗栓基因、降低促栓基因发挥内皮功能保护作用。我们前期预实验显示，雷帕霉素可降低培养的HUVEC中以及兔髂动脉壁内的KLF2表达，同时下调抗栓基因的表达。故本课题拟观察雷帕霉素导致内皮功能失调是否由KLF2降低来介导。体外实验，培养HUVEC，观察不同浓度雷帕霉素对KLF2的DNA结合、mRNA表达和相关内皮功能基因表达的影响，并观察KLF2质粒转染是否可逆转内皮功能失调；动物实验将SES置入兔髂动脉，观察KLF2以及相关内皮功能基因的表达，并将KLF2转染至SES置入血管，观察是否可逆转内皮功能失调。由此了解SES置入后内皮功能失调的分子机制，并为将来的防治工作提供线索。

本实验的目的是通过采用不同浓度的雷帕霉素作用于人脐静脉内皮细胞，探求转录因子KLF2在雷帕霉素导致HUVECs抗栓功能失调中的作用。同时制作大鼠颈动脉球囊拉伤模型，给予雷帕霉素干预处理，模拟雷帕霉素药物洗脱支架作用原理，明确支架血栓发生的机制，为临床治疗的发展提供新的依据。. 实验方法：1.体外实验：采用不同浓度的雷帕霉素作用于凝血酶刺激的HUVECs，孵育24和48小时后，观察KLF2的活性和表达的变化，以及血栓相关因子的表达变化。又采用siRNA-KLF2转染至HUVECs，将雷帕霉素作用于siRNA-KLF2转染后的HUVECs继续孵育24小时。检测KLF2及相关因子的表达变化。2.体内实验：将70只雄性Wistar实验大鼠随机分为7组:(1)单纯球囊损伤组；(2)假手术组；(3)球囊损伤+雷帕霉素泵入组；(4)假手术+雷帕霉素泵入组；(5)单纯病毒转染组；(6)病毒转染+球囊损伤+雷帕霉素泵入组；(7)病毒转染+假手术+雷帕霉素泵入组；参照Tulis方法建立大鼠颈总动脉球囊损伤模型。术后7d处死大鼠，切取损伤处血管。用于Western Blot、RT-PCR及免疫组化。. 实验结果：雷帕霉素作用于HUVECs，TF和PAI-1表达呈雷帕霉素浓度依赖性增加，eNOS和t-PA的表达呈雷帕霉素浓度依赖性降低；高浓度雷帕霉素作用于HUVECs使KLF2的表达增加。其中200ng/ml组KLF2的mRNA表达与对照组相比增加2.3倍；而2000ng/ml组与对照组相比增加3.2倍。KLF2与生物素标记的DNA序列结合，证实KLF2活性升高。雷帕霉素200ng/ml孵育的情况下，KLF2-siRNA组与空白质粒组相比TF表达进一步增加，eNOS表达进一步减少。表明KLF2沉默后，放大了雷帕霉素对内皮细胞的促栓效应。. 动物实验部分可见与假手术组相比，球囊损伤+雷帕霉素泵入组KLF2表达升高，抑制了eNOS和t-PA的表达,升高了TF以及PAI-1的表达；与单纯质粒转染组比较假手术组可见eNOS、t-PA表达升高， PAI-1的表达降低；质粒转染后损伤组大鼠的eNOS、t-PA表达降低不明显， TF和PAI-1的表达升高也不明显；而质粒转染后泵入雷帕霉素，与单纯质粒转染组比较，eNOS、t-PA表达降低，TF、 PAI-1的表达升高也不明显。