dsRNA在苏云金芽孢杆菌中的表达及其效应

The dsRNA expression vector will be developed firstly for Bacillus thuringiensis Bt and then one specific region of arginine kinase (AK) cDNA of diamondback moth, Plutella xylostella will be inserted into the expression vector to produce transgenic strain which could produce AK dsRNA. The physiological and biochemical characteristics of transgenic Bt strains will be examined to select the strain which could grow as well as the non-transgenic Bt and stably produce high level of AK dsRNA. The selected transgenic Bt will be cultured and fed to the larvae of diamondback moth to examine the lethality in different concentrations. The effects of transgenic Bt will be further investigated by examining the survival, growth and propagation of diamondback moth. In the meanwhile, the expression of AK in diamondback moth will be determined to verify the effects of AK dsRNA in transgenic Bt. The dsRNA expression vector from this study will facilitate the engineering of Bt for improving its toxicity. This study will also provide a practical way for the application of RNAi technology in pest management.

构建适合于苏云金芽孢杆菌Bt中表达dsRNA的载体，并将小菜蛾精氨酸激酶基因片段导入载体，获得表达小菜蛾精氨酸激酶基因dsRNA的Bt。进一步检测转基因Bt的生理生化特征和dsRNA的表达，获得不影响Bt正常性状，又能表达dsRNA的转基因Bt。用转基因Bt喂食小菜蛾，测定其杀虫活性；利用生命表方法，测定转基因Bt对小菜蛾的存活、生长发育和繁殖的影响；检测取食转基因Bt的小菜蛾精氨酸激酶基因表达情况，明确其表达受抑制程度。本项目的dsRNA表达载体，将有助于Bt的工程菌改造以提高毒性；同时也为RNAi技术在害虫控制应用寻找到一条可实践的途径。

RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）技术已被开发利用于害虫控制，但具体的应用技术还有待进一步研究。本论文尝试在苏云金芽孢杆菌（Bt）中表达小菜蛾精氨酸激酶基因（PxAK）的dsRNA，通过Bt介导来沉默小菜蛾上的PxAK，达到杀虫的目的，以期为RNAi技术在小菜蛾防治中的应用提供新的途径。具体研究内容与结果如下：.选取小菜蛾精氨酸激酶基因保守区域的325 bp片段（AKi）作为RNAi的靶标。克隆Bt的启动子序列pro3a，在其后连接上AKi，然后连接到质粒pHT304上，最后把启动子pro3a反向连接到AKi的另一端，得到质粒pHT304+pro3a(+)+AKi+pro3a(-)，命名为pHTAKR。利用重叠延伸PCR技术突变pHTAKR中来自质粒pHT304的Sph I酶切位点，从而获得只有单个Sph I酶切位点的载体pHTAKR2。利用电穿孔技术把载体pHTAKR2分别转入Bt BMB171和Bt 8010，获得工程菌BMB171-AKi和8010-AKi。.经检测，工程菌8010-AKi中存在晶体蛋白，但晶体数量比Bt 8010少，且形状由菱形为主转变成菱形、方形、椭圆形等多种形状并存；工程菌8010-AKi的生长速率在对数期比菌株8010慢，形成的芽孢数也少；在经选择压处理的工程菌8010-AKi中，30代内外源质粒pHTAKR2的稳定性都在90%以上。.用Bt菌液浸泡处理的叶片喂饲小菜蛾，发现工程菌8010-AKi处理的小菜蛾幼虫在两天后开始出现死亡，第六天死亡率达60%，死亡个体主要出现体节皱缩，胸部扁缩等由于AK被抑制后的形态，但比8010的死亡率低；工程菌BMB171-AKi处理的幼虫第六天死亡率达53.3%，比BMB171的死亡率高，其死亡个体也出现了体节皱缩等由于AK被抑制后的形态，而无因Bt毒蛋白而死亡的形态。工程菌8010-AKi干扰后的实时荧光定量PCR结果表明，经过处理的小菜蛾幼虫，其PxAK表达被抑制。这意味着采用工程菌介导对小菜蛾幼虫进行RNAi是有效。.本研究首次利用Bt介导RNA干扰，通过喂饲小菜蛾来抑制PxAK的表达，从而影响小菜蛾的生长发育。如此可见，把杀虫微生物和RNAi技术相结合是可行的。