基于微流控芯片技术的EphB4调控乳腺癌干细胞EMT的研究

EMT is a key step in breast cancer stem cells invasion and metastasis, but the mechanism is still unclear. Our preliminary study showed that up regulation of EphB4 protein expression could promote the EMT process of breast cancer stem cells, the expression level of AKT and mTOR in highly expressed breast cancer stem cells are obviously elevated, and EphB4 also occured co-immunoprecipitation in the breast cancer stem cells with PTEN protein. Therefore, we hypothesized that the EphB4 protein may block the inhibition of PTEN on PI3K/AKT/mTOR pathway by interaction with PTEN protein thereby contributing to the induction of EMT process of breast cancer stem cells. To demonstrate this suppose, based on the superiority of the micro-fluidic chip technology in simulate the three-dimensional environment in vivo, we intend to construct the micro-fluidic chip platform to research the EMT process in breast cancer stem cells. We will detect the factors changes in EMT process and PI3K/AKT/mTOR pathway through control the expression levels of the EphB4 in breast cancer stem cells. This project is devoted to illuminate the regulation mechanism of the EphB4 in the EMT process and may contribute to the further study in the breast cancer stem cells invasion and metastasis by induction of EMT process.

EMT是乳腺癌干细胞侵袭和转移的关键步骤，但机制不明。我们前期研究发现：上调EphB4蛋白表达可促进乳腺癌干细胞EMT过程；同时，高表达EphB4的乳腺癌干细胞中AKT和mTOR的表达水平明显上升；且EphB4还可与PTEN蛋白发生免疫共沉淀。因此我们推测：EphB4蛋白可能通过与PTEN相互作用，阻碍了PTEN对PI3K/AKT/mTOR信号通路的抑制作用，从而促进乳腺癌干细胞发生EMT。为了证明这一假设，本项目拟利用微流控芯片技术能够模拟体内三维环境的优势，构建适合乳腺癌干细胞 EMT研究的微流控芯片平台，以乳腺癌干细胞为研究对象，检测EphB4表达上调和下调等不同条件下，乳腺癌干细胞EMT和PI3K/AKT/mTOR信号通路相关因子变化，阐明EphB4对乳腺癌干细胞EMT的调控机制，为进一步通过抑制EphB4控制乳腺癌侵袭和转移提供理论依据。

为更好地模拟体内环境，我们课题组改良了适合BCSCs生长及检测的双层微流控芯片，并优化和经济化适合BCSCs生长及检测的双层微流控芯片，并在该芯片平台上对BCSCs进行了三维立体培养及二维培养，研究结果对比发现三维立体细胞培养较二维培养有明显优势。同时，我们分析了美国TCGA数据库中近1000名乳癌患者的基因表达数据，发现较正常乳腺组织，EphB4及EFNB2在乳腺癌组织中表达水平较高，且在HER2阳性亚型中表达明显增高(p<0.001)。接下来，我们利用大连医科大学附属第二医院乳腺肿瘤科收集的肿瘤标本库及组织芯片技术，使用免疫组织化学方法检测了94例乳腺癌患者癌症组织中的EPHB4蛋白表达水平，验证了乳腺癌HER2阳性亚型中EPHB4蛋白水平表达水平较高，并具有统计学差异。然后我们随访比较了患者生存数据，发现EphB4高表达及低表达组间OS无显著差异(p=0.188)，而EphB4及EFNB2共表达提示较差的预后(p=0.0224)。为深入研究EPHB4影响乳腺癌预后的机制，我们以乳腺癌细胞系MDA-MB-231 和MCF-7为模型敲低EPHB4，发现敲减后乳腺癌细胞系增殖能力受到抑制，迁移能力下降。同时蛋白印记方法检测到敲减组的pAKT及m-TOR水平均较对照组明显降低，预示下调EPHB4表达可抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路；同时，上调EphB4 蛋白表达可促进BCSCs的EMT 过程，高表达EphB4 的乳腺癌干细胞中pAKT 和mTOR 的表达水平明显上升，且EphB4 还可与PTEN 蛋白发生免疫共沉淀， EphB4 可通过与PTEN 相互作用，阻碍了PTEN 对PI3K/AKT/mTOR 信号通路的抑制作用，从而促进乳腺癌干细胞发生EMT，参与乳腺癌转移。我们证明了EPHB4在乳腺癌中发挥着重要作用。本课题组也应用我们自己构建的乳腺癌组织库，采用免疫组织化学方法及数据库分析等手段，发现了一个三阴性乳腺癌患者预后预测的可靠指标—CCR7蛋白，其有望成为三阴性乳腺癌靶向治疗潜在靶点。除以上研究结果，我们还在国内率先构建了具有高保真性的乳腺癌原代培养及PDX动物模型，并在临床推广，已经极大地提高患者用药合理性，引领了个体化治疗的方向。