持家酶GAPDH和FBA分泌机制的解析与关键表位多肽的筛选

Housekeeping enzymes GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) and FBA (Fructose-1, 6-bisphosphate aldolases) are ubiquitously present in almost all microorganisms to perform essential function in glycometabolism. Recently, secreted GAPDHs were found in many pathogens and played an important role in adhesion and/or virulence. And we previously found that GAPDHs of six pathogens in aquaculture were secreted into extracellular medium and periplasmic space. The remarkable cross-protective immunities of these recombinant GAPDHs were induced in zebrafish and the recombinant FBA was found to lead a high RPS (about 69%) in turbot against Edwardsiella tarda EIB202. In this work, we centered on E. tarda to estabilish intrinsic association between these secreted houskeeping proteins and virulence, identify the main secretory pathways and molecular chaperones so as to elucidate the molecular mechanism of GAPDH and FBA secretion. Meanwhiel, the key epitope petides of GAPDH and FBA were screened against E. tarda, Vibro anguilluram and Aeromonas hydrophila, which will provide new target for the vaccine design against polymicrobial pathogens in aquaculture.

持家酶GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）和FBA（果糖1,6-二磷酸醛缩酶）是糖代谢中的关键酶之一，广泛存在细菌中并高度保守。近年来，在链球菌等多种病原菌中发现GAPDH能分泌到胞外，在粘附、定植宿主细胞中具有重要作用，其对病原菌的免疫保护作用也被证实。我们在前期研究中，不仅证实了GAPDH在六种水产养殖鱼类致病菌中能分泌到胞外并具有交叉免疫保护作用，同时发现迟钝爱德华氏菌中的FBA也具有较好的免疫保护作用。本项目拟对迟钝爱德华氏菌GAPDH和FBA的胞外分泌情况与病原毒性强弱关系进行分析，鉴定其分泌途径及协助其分泌的分子伴侣蛋白，进而阐明其分泌的分子机制；同时进行GAPDH和FBA关键表位多肽的筛选，为水产养殖多病原协同感染环境下的疫苗设计提供新靶点。

持家酶GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）和FBA（果糖1,6-二磷酸醛缩酶）是糖代谢中的关键酶之一，广泛存在细菌中并高度保守。近年来，在链球菌等多种病原菌中发现GAPDH能分泌到胞外，在粘附、定植宿主细胞中具有重要作用，其对病原菌的免疫保护作用也被证实。在前期研究中，我们证实了GAPDH在六种水产养殖鱼类致病菌中能分泌到胞外并具有交叉免疫保护作用，同时发现迟钝爱德华氏菌中的FBA也具有较好的免疫保护作用。故本项目主要针对这两个蛋白进行胞外分泌的分子机制研究及它们的关键表位多肽筛选，以期确立胞外分泌情况与病原毒性强弱间的关系，为水产养殖多病原协同感染环境下的疫苗设计提供新靶点。.研究中对50株爱德华氏菌完成了胞外GAPDH和FBA含量与毒力相关性分析，发现胞外GAPDH和FBA分泌量的高低与病原菌毒力强弱无显著关联，但能促进病原菌的细胞黏附作用；不同缺陷株的GAPDH和FBA胞外分泌发现其不通过经典分泌途径或者OMVs分泌到胞外；基于Western blot和qRT-PCR实验分析、突变体文库的筛选等研究表明GAPDH和FBA的胞外分泌存在精确调控，可能受到基因esrA和esrC的调控；pull-down实验的筛选发现FBA与SecB存在相互作用，暗示着FBA可能通过Sec分泌途径转运至周质空间进而转运到胞外；而FBA蛋白的过表达等分析显示C端序列特征显著影响其胞外分泌，胞外分泌蛋白质组的差异分析表明FBA的胞外分泌与T3SS和T6SS分泌系统间可能存在正/反向的协同性；免疫保护作用分析证实了GAPDH和FBA对六种常见海洋水产养殖病原菌均具有良好的保护力；基于分段表达策略与免疫保护力的分析证实GAPDH的关键表位肽存在与该蛋白的111~280位氨基酸序列中，FBA的关键表位肽存在与该蛋白的181~240位氨基酸序列中；两重组蛋白的抗原递呈过程解析表明两关键表位肽能进行串联表达及共同免疫，可用于广谱型疫苗的开发。项目实施总体达到了既定目标，为未来GAPDH和FBA胞外分泌调控机制的精确解析及疫苗的开发应用奠定了良好基础。