基于等温酶辅信号放大和立体模板DNA银簇的诺如病毒超灵敏低成本快速检测方法研究

Developing ultrasensitive and cost-effective methods for fast detection of Norovirus is of great importance and significance since foodborne Norovirus bears strong infectious ability and poses high hazardous risk of causing epidemic outbreak, especially in the underdeveloped region with scarce analytical instruments. During this research program, we intend to develop ultrasensitive and cost-effective methods for fast and visual detection of Norovirus. The developing strategy is based on the enzyme-assisted isothermal amplification and synthesis of high-bright DNA silver nanoclusters (AgNCs) capped by tridimensional DNA structures. The employment of stem-loop structure probe and DNA three-way junction makes it facilitative for directly detecting Nororius RNA without reverse transcription, and the synthesis of DNA-AgNCs contributed an enhanced fluorescent signal output with second amplification and ultrasensitive detecting capacity. The findings and experimental data in this report may also be a potent supplementary proof for later exploration and explanation the fundamental of AgNCs’ photoluminescence. And more importantly, the strategy could be applied for ultrasensitive, cost-effective and fast detection of other foodborne viruses.

食源性诺如病毒具有传染性强，易爆发易流行，危害范围大且不易控制等特点，建立诺如病毒的高灵敏低成本快速检测方法，尤其在危害风险大检测资源匮乏的地区，具有非常重要的意义。本项目拟基于茎环结构探针和DNA三通节结构设计无需反转录的等温酶辅信号放大步骤，以实现对输入信号的快速放大；并基于高荧光量子产率的三维模板DNA银簇的组装合成，实现输出信号从无(弱)到强的二次放大，达到超高检测灵敏度和可视化检测的目标，旨在建立靶向诺如病毒RNA的超灵敏低成本的快速可视化荧光检测方法。这项研究中新型三维模板DNA银簇的合成将进一步论证具有空间结构的DNA模板对银簇的增强作用，有望揭示高荧光量子产率DNA银簇的发光机理；另一方面，这一信号放大检测策略可成为食源性病毒超灵敏低成本快速检测的普适性方法。

诺如病毒具有传染性强，易爆发易流行，危害范围大且不易控制等特点，流行病学监测结果表明我国诺如病毒感染腹泻暴发疫情报告数逐年上升，因此诺如病毒的准确和快速检测，对于公共食品安全以及疫情的及时发现和控制具有非常重要的意义。发展快速高灵敏的分子生物学检测方法，有助于受污染食品的的早期发现和处理，对于疫情的精准确认和有效控制也具有重要意义。本项目以诺如病毒检测的技术要求和现实需求为出发点，借助等温信号放大策略，开展DNA银簇合成研究并以其为荧光信号输出单元，以诺如病毒核酸为靶标，发展高灵敏度低成本的快速可视化检测方法。. 项目中首先开展了DNA银簇合成研究，分别以单链DNA、茎环DNA和三维DNA结构为模板，研究了序列、结构、合成条件等对银簇光学性质的单因素影响及协同影响，数据显示CG碱基在DNA银簇合成中对其性质的影响非常大，对于单链DNA序列中需含有C碱基才可合成银簇，G碱基在序列中的不同插入方式（侧面或中间）都可增强其荧光强度；而对于茎环结构来讲，一定长度范围内茎部序列越长，茎环银簇的发光强度越高，随着茎部CG碱基含量比例的增加，银簇发射波长逐渐红移，在过程中由单发射波长变为双发射波长再变为单红光发射，pH和银离子浓度对银簇的波长也有协同影响作用，高pH条件和高银离子浓度均下有利于红光银簇的形成；具有一定内部空间的DNA结构的形成可增强银簇的发光强度，这可能是由于银簇表面电子云密度的提高有利于表面激子共振，且可提高银簇的稳定性，这可能是由于这种“包裹”作用一定程度上保护银原子免受水中氧自由基的淬灭。. 项目基于银簇合成的结论，分别使用自筛选的单链DNA、茎环DNA、“灯泡”状三维DNA等为模板合成银簇并以之为信号输出单元，分别基于外切酶辅助循环信号放大、翘板门信号放大、链置换扩增信号放大、杂交链式反应信号放大这些等温信号放大策略，建立了诺如病毒cDNA和RNA的高灵敏检测方法。在外切酶辅助循环信号放大策略设计和研究过程中，发现并首次提出三通节结构可显著提高酶剪切效率。