CRISPR-Cas9介导的免疫卡控点基因敲除的EBV-CTL在EBV相关胃癌免疫治疗中的应用价值

EBV associated gastric carcinoma is one of the most important subtype of gastric cancer according to the latest molecular classification. It is characterized by the up-regulation of immune regulated pathway such as PD-1/PD-L1. Based on our previous success to overcome the immune tolerance by CRISPR-Cas9 mediated gene knockout of PD-1 on activated T cells, this project aims to further explore the immune checkpoint genes which mediated immune tolerance on EBV associated gastric carcinoma and to generate immune checkpoint gene disrupted CTL targeted to EBV antigen. Moreover, this project is to evaluate the coordinate effect of this cellular therapy with low dose radiotherapy for the treatment of EBV associated gastric carcinoma. The aim of this project is to establish a new mode of comprehensive immunotherapy for the clinical application.

EBV相关胃癌是胃癌分子分型中的重要类型之一。PD-1/PD-L1等免疫调控通路的活化是该类型胃癌的重要特征。申请人在前期成功采用CRISPR-Cas9技术敲除活化T细胞中的PD-1 分子以逆转免疫耐受的基础上，以EBV相关胃癌为研究对象，进一步明确在EBV相关胃癌中介导免疫耐受的免疫卡控点基因；进一步建立靶向于EBV抗原的系列免疫卡控点基因敲除的CTL（细胞毒性T细胞）的方法；并通过联合低剂量放疗协同免疫细胞效应作用的发挥，由此建立一种新型的综合免疫治疗模式，评估该治疗模式在EBV相关胃癌治疗中的价值，为今后的临床应用提供依据。

申请人所在的团队在前期构建了CRISPR-Cas9系统介导的PD-1敲除的T细胞的研究基础上，进一步探索了CRISPR-Cas9系统介导的PD-1敲除的CTL的临床应用价值，尤其对于EBVaGC类型的肿瘤具有潜在的治疗优势。本研究通过GEO公共数据库，选取EBVaGC全基因组mRNA表达数据集进行分析，结果发现，PD-1、TNFSF14、IDO1、TIM-3、CTLA4、TIGIT、IDO2以及CD80等免疫卡控点基因及相关免疫调控基因的表达均明显高于EBVnGC组织，研究分析提示，EBV感染会导致一系列免疫卡控点上调，尤其是PD-1，该基因的上调表达参与肿瘤免疫的调节。提示以PD-1、PD-1等为代表的免疫卡控点基因敲除有望增强免疫细胞治疗在EBV相关肿瘤中的疗效，而联合放疗后更有望克服免疫细胞不能有效到达肿瘤部位的缺点，使抗肿瘤作用得到更好的发挥。进一步，本研究对CRISPR-Cas9系统介导的以PD-1为基础的双敲除体系的可行性进行了初步验证，结果提示，免疫卡控点基因的联合敲除切实可行，免疫卡控点基因的联合敲除有望克服单一卡控点基因敲除后其他免疫卡控点基因上调后诱导的免疫耐受的形成，从而进一步增强T细胞抗肿瘤免疫应答的功能，然而，这部分工作仍有许多探索尚在进行中，需要进一步的验证工作。