紫云英二磷酸核苷磷酸酯酶AsIA257在共生固氮过程中的功能研究

AsIA257是本研究室前期发现的一个紫云英共生特异表达的二磷酸核苷磷酸酯酶（Diphosphonucleotide phosphatase，PPD）。本申请拟采用体外真核表达系统鉴定AsIA257的水解底物；通过构建AsIA257和红色荧光蛋白的融合蛋白来研究其亚细胞定位；进一步获得AsIA257超表达和沉默的转基因植株，检测其结瘤表型、根瘤与类菌体发育情况、根瘤ADP和ATP/ADP水平、以及固氮酶活的变化，并利用T1代再生植株进行表型确证。从而阐明AsIA257在共生固氮过程中的功能，并初步揭示其作用机制。.迄今为止，国内外没有PPD和固氮相关的报道。本申请的研究结果将首次阐明共生特异的宿主PPD对共生固氮的调控功能，丰富我们对固氮调控分子机理的认识，为深入研究PPD表达的调控机制打下良好的工作基础。同时本申请项目的完成也可为提高共生固氮效率提供一定的理论依据和新思路。

二磷酸核苷磷酸酯酶是酸性磷酸酶的一个亚家族，对二磷酸核苷和磷酸二酯键表现出较高的水解活性。本项目基于前期工作基础，克隆了紫云英共生固氮相关新基因AsPAP1的全长，预测其编码二磷酸核苷磷酸酯酶，并获得直接的实验证据，证明该蛋白在共生固氮中发挥重要作用。(1) 荧光定量检测结果表明AsPAP1基因在接种根瘤菌后的根和根瘤中上调表达，特别是处于固氮活跃期的根瘤表达量较高。采用低磷条件处理后，AsPAP1基因的表达量在接种后的根中降低而在根瘤中却升高。说明AsPAP1 与共生固氮相关，而它对磷饥饿的反应与传统的PAP不同。(2) AsPAP1-DsRed蛋白的亚细胞定位结果表明：融合蛋白在洋葱表皮和接种后的毛根细胞中均定位于细胞膜；而在根瘤中定位于细胞膜和胞质。该结果暗示AsPAP1除定位于细胞膜外，还可能定位于共生体膜，与类菌体的固氮功能相关。(3) 将AsPAP1在毕赤酵母中诱导表达并测定体外酶活，结果表明：重组蛋白具有酸性磷酸酶和磷酸二酯酶的活性；HPLC检测发现它能够体外水解ATP和ADP且对ADP的水解能力高于ATP。(4) 利用发根农杆菌介导将AsPAP1在紫云英毛根中超表达后，发根的结瘤受到抑制，而AsPAP1沉默则导致产生无效根瘤且根瘤数增多。荧光显微镜观察发现AsPAP1表达量的变化影响了根瘤原基的数量。以上结果说明AsPAP1与根瘤的形成和类菌体的固氮功能相关。本项目首次获得直接实验证据证明PPD参与根瘤菌与豆科植物共生固氮的调控，为深入研究它在共生固氮中的作用机制打下良好基础。