紫云英根瘤中特异表达的转脂蛋白新基因AsE246的鉴定及其在共生固氮中的功能研究

AsE246是我们首次报道的紫云英根瘤特异表达的编码非特异性转脂质蛋白（nsLTP1: non specific lipid transfer protein）基因。本项目拟通过定量PCR和原位杂交研究其时空表达和组织定位；通过体外蛋白表达检测其生物活性；采用基因超表达和RNA沉默技术，利用发根农杆菌介导的紫云英遗传转化和再生植株体系，比较研究AsE246超表达和RNA沉默的转化植株和对照植株在根瘤发育、结瘤表型、根瘤茉莉酸含量、固氮酶活和植株含氮量等方面的变化；最后通过酵母双杂交钓取相互作用的宿主靶蛋白，完成蛋白互作的鉴定和体内共定位。进而获得直接实验证据鉴定AsE246新基因和阐明其在紫云英共生固氮过程中的功能。.本项目的预期完成将揭示豆科植物根瘤特异表达的nsLTP1基因在共生固氮中的功能，为后续深入研究AsE246调控机制打下基础，更为共生固氮分子机理研究提供一些原始创新进展，

在本项目的前期工作中，用抑制差减杂交法从紫云英（Astragalu sinicus）根瘤的cDNA文库中筛选出新的根瘤特异表达基因AsE246。该基因编码非特异的转脂质蛋白（nsLTP1），植物中的nsLTP蛋白多参与植物对病原微生物的防御和植物发育的调控过程。. 本基金项目对紫云英转脂质蛋白基因AsE246进行了表达和功能研究。实时荧光定量PCR结果表明：AsE246在紫云英接种根瘤菌9天后开始表达，21天达到高峰。原位杂交表明AsE246仅在成熟根瘤中具有固氮能力的固氮Ⅲ区表达。在洋葱表皮中的亚细胞定位表明：AsE246在细胞质膜上表达。将AsE246和红色荧光蛋白构建成融合蛋白，在紫云英的根毛侵染线和根瘤的共生体膜上观察到融合蛋白的表达。体外表达的AsE246重组蛋白和多种脂类物质及茉莉酸有不同结合活性，尤与18碳脂肪酸有较强结合活性。分别构建了AsE246沉默和超表达的紫云英转化植株，AsE246超表达植株显著提高了结瘤数量，AsE246沉默株瘤数显著减少。已有的实验证据表明在紫云英和华癸根瘤菌共生过程中参与了脂类物质的信号传导。. 通过酵母双杂交，从紫云英cDNA文库中筛选出与AsE246互作的阳性克隆AsDJL1。AsDJL1全序列1650bp，编码DnaJ-like蛋白，由四个结构域组成。荧光定量PCR表明该基因在固氮根瘤中增强表达。用酵母小范围杂交，确定了AsDJL1与AsE246互作的关键结构域是AsDJl1-c-zf. 进一步用pull-down、western blot 和荧光双分子互补技术 （BIFC）验证了AsDJL1与AsE246在体外存在相互作用。分别构建了AsDJL1沉默和超表达的紫云英转化植株，盆栽表明AsDJL1基因被沉默或超AsDJL1基因的时空表达特征与AsE246表达对紫云英共生固氮的表型有显著影响。.以上结果表明AsE246参与了紫云英共生固氮的侵染线形成、根瘤发育、共生体膜脂质信号传导等多个过程，AsDJL1与AsE246存在相互作用，也与紫云英共生固氮过程有较高相关性。