海参 i-型溶菌酶的酶和非酶抗菌活性的作用机理研究

本课题的前期研究已发现，海参i-型溶菌酶比商品化使用的蛋清溶菌酶具有更广谱的抗菌作用，尤其对通常引起水产动物严重病害的病原菌革兰氏阴性菌（G-）具有明显的抗菌效果，而蛋清溶菌酶只对革兰氏阳性菌（G+）起作用。另外，还发现海参i-型溶菌酶加热失活后，其抗菌活性比原酶提高了20-30%。在此基础上本课题将运用细胞生物学、分子生物学和生化分析等手段，系统研究如下两个问题：（1）海参i-型溶菌酶对G- 的作用机理，重点探讨该溶菌酶对G- 菌细胞壁外膜上脂多糖的亲和性；（2）海参i-型溶菌酶的非酶物质对G+ 和G- 抗菌活性的作用机理，试图从该溶菌酶的基因结构中分离具有抗菌活性的肽段结构，再研究该编码产物对细菌细胞表面电荷和表面疏水性的影响，以及对细菌细胞膜通透性的影响。目的是为寻找具有广谱抗菌活性的新型溶菌酶奠定理论基础，并为畜牧、水产养殖业及食品工业等领域应用不同来源的溶菌酶提供理论指导。

该基金项目经三年时间的刻苦努力，已按计划全部完成预计目标，取得一些重要研究成果。同时，又增加了一些相关的、有价值的、新的研究内容，目的在于不断探索和创新，把该领域的研究水平向深度和广度拓展，使我们的研究成果处于国际上领先的地位。现将主要研究结果总结如下：.1. 完整地构建了重组海参溶菌酶全长基因，N-端基因和C-端基因的原核细胞表达的基因工程菌，并系统地做了工程菌高效表达重组海参溶菌酶（rSjLys），海参溶菌酶N-端多肽（rSjLys-N）和C-端多肽（rSjLys-C）实验研究，并对目的蛋白或多肽rSjLys，rSjLys-N和rSjLys-C的可溶性做了定量分析。.2. 利用rSjLys，rSjLys-N和rSjLys-C的精制产品做了对革兰氏阳性菌和阴性菌的抑菌谱分析。结果发现该重组海参溶菌酶及多肽对革兰氏阴性菌和阳性菌均有抑制作用，尤其对水生动物中常见的革兰氏阴性致病菌弧菌和假单胞菌有明显的抑制作用。另外，加热失活后的SjLys和SjLys-C对革兰氏阴性菌和阳性菌的抑菌能力普遍提高了10  25%，这对海参溶菌酶及多肽产品作为饲料添加剂的应用非常有益。.3. 以重组海参溶菌酶C-端多肽（rSjLys-C）为模板，采用通过分子动力学模拟方法系统研究了海参溶菌酶中的非酶结构物质的抗菌作用机理。模拟结果表明，在高温下（100℃）SjLys-C蛋白能维持构象的高度稳定，并且 SjLys-C多肽4个区域内的氨基酸残基具有较高的温度敏感性。分子动力学模拟的结果很好地与体外抑菌实验的结果相匹配，从而为解释SjLys-C蛋白加热后抑菌活性增强提供了必要的分子水平上的理论依据。.4. 从海参肠道和海参养殖圈淤泥和水体中筛选得到了具有生物活性高的几株益生菌，包括枯草芽胞杆菌，乳酸杆菌，酵母菌，光合细菌和硝化细菌。这些益生菌经适当的基因改造，可以成为海参溶菌酶和多肽基因工程菌的最理想的宿主，这将获得真正意义上的安全、绿色的海参溶菌酶和多肽生物制品。.5. 到目前为止，已发表科研论文14篇，其中2篇为SCI收录，1篇为EI收录，其它为中文核心期刊；获国家授权专利2项；向国际核酸数据库GenBank提交并发表了6个海参益生菌16S rDNA基因序列。近三年来，培养研究生15名，参加国际和国内学术会议4次，其中有2次做大会学术报告，并主办了一次全国性的学术会议。