犬小孢子菌膜蛋白PQ-LRP基因全长cDNA的克隆及功能分析

犬小孢子菌病是由亲动物性犬小孢子菌感染人类头皮、平滑皮肤的传染性皮肤病。近年随着宠物饲养的增加，其发病率呈上升趋势。本课题组前期通过SSH技术成功构建了犬小孢子菌差异基因文库，通过比较儿童头皮诱导培养和儿童光滑皮肤生长状态下的犬小孢子菌基因表达的差异性，从中筛选出与头皮诱导培养相关的5条差异表达基因，并对获得的目标基因进行测序及实时荧光PCR定量，其中膜蛋白PQ-LRP基因在头皮诱导培养下较光滑皮肤具有高表达，这是否与犬小孢子菌易于感染儿童头皮有关引起我们的关注。目前国内外学者对犬小孢子菌膜蛋白的研究相对较少。故本课题组拟依据差异显示得到的PQ-LRP基因片段采用RACE得到PQ-LRP基因全长序列，运用RNA干扰技术使PQ-LRP基因沉默，运用实时PCR和Western blotting检测其表达量及利用动物实验感染模型，探讨犬小孢子菌PQ-LRP基因在头癣发病机制中的作用。

课题“犬小孢子菌膜蛋白PQ-LRP基因全长cDNA的克隆及功能分析”为国家自然基金资助项目（编号81071330），历经3年（2011-2013）已按原计划顺利圆满地完成预定任务，取得如下成果：.1．成功克隆了犬小孢子菌膜蛋白PQ-LRP基因全长cDNA:获得PQ-LRP基因序列全长1522bp，用ORF finder 分析，含有一个从50bp-1129bp长为1080bp的开放阅读框，编码359个氨基酸，并且得到5'端非编码区49bp，3'端非编码区393bp。已提交至GenBank（JF767222）。.2．成功构建并鉴定了犬小孢子菌PQ-LRP基因RNA干扰载体：(1)成功构建了RNA干扰载体pCB309-PLULT：将LPR正向干扰序列600bp连接到pUC-PUT载体的Ptrpc启动子和间隔序列之间，得到载体pUC-PLUT载体。将LPR反向干扰序列600bp连接到pUC-PLUT载体的间隔序列和Ttrpc终止子之间，得到载体pUC-PLULT。将pUC-PLULT上的PLULT片段（3.4 kb）通过酶切，与pCB309 (5.4 kb)连接，得到了载体pCB309-PLULT。( 2)将pCB309-PLULT质粒用电转化的方法转到根癌农杆菌EHA105中，完成了pCB309-PLULT质粒的根癌农杆菌转化。.3．用Real Time PCR法对犬小孢子菌PQ-LRP基因干扰前后的mRNA相对表达量的分析：干扰后PQ-LRP基因表达水平较干扰前下调61%。.4．犬小孢子菌PQ-LRP基因沉默后对形态的影响：(1)菌落：干扰后气中菌丝减少，色素变浅。(2)显微镜下：干扰后大分生孢子弯曲、细长、分隔不规律。(3)超微结构：扫描电镜：大小分生孢子干扰后弯曲、皱缩、甚至破壁，菌丝不饱满。透射电镜：大分生孢子干扰后细胞壁增厚、壁破、细胞核及细胞器减少。.5．建立了犬小孢子菌PQ-LRP基因干扰前后致豚鼠感染模型：(1)模型特征：干扰株较野生株红斑小，炎症轻。(2)致病豚鼠真菌镜检：野生株与干扰株均可见发内外孢子，不同的是干扰株孢子量少，菌丝粗细不一。.6．半胱氨酸对犬小孢子菌PQ-LRP基因干扰前后的mRNA相对表达量的分析：干扰前随半胱氨酸的浓度增加PQ-LRP基因表达水平上调明显，干扰后PQ-LRP基因表达变化不明显。.7．已发表相关论文4篇